载体家小课堂 | AAV在神经系统研究中的应用

由于中枢神经系统（Central nervous system, CNS）的复杂性，神经组织的有限再生能力，血脑屏障（Blood‒brain barrier, BBB）对药物输送的限制，采用传统药物和外科手术方法治疗神经系统疾病仍然很困难，目前科学家正在研究使用基因疗法治疗神经系统疾病[1] 。基因治疗能够将基因的正常拷贝放入细胞，从而改变细胞的工作方式，达到治愈目的。为了将基因插入细胞，基因疗法使用载体将基因放入细胞。

AAV 病毒载体是极具应用前景的基因给药工具。野生 AAV 被认为是非致病性的，感染个体后产生的免疫应答水平极低，无法自行复制，需依赖于与腺病毒或疱疹病毒的共同感染才能复制。

重组 AAV 载体自身只需携带一个顺式元件，ITR，就能生产出重组 AAV 颗粒。由于缺乏 Rep 基因，重组 AAV 病毒基因组不整合宿主基因组，以染色体外形式长期存在，在非分裂细胞（如神经元）中也能实现治疗性蛋白的持久表达，安全性极高[2] 。另外，多种血清型 AAV 对神经细胞具有良好嗜性。

载体家长期致力于高质量的 AAV 载体构建、AAV 病毒包装，旨在让您的研究更高效。

 

ssAAV vs. scAAV

与传统的单链（single-stranded, ss）基因组 AAV 载体相比，自我互补（self-complementary, sc）AAV 载体具有更高的转导效率和更快的转导动力学。ssAAV 载体通过宿主介导的 DNA 合成方式转化为活性的双链 DNA 形式。 因此，双链 DNA的生成是 ssAAV 载体转导中的限制步骤。由于基因组只能使用一半，scAAV 适合作为小基因的载体[3] 。载体家提供ssAAV、scAAV 两种 AAV 载体构建以及病毒包装服务。

神经嗜性AAV血清型

载体家提供的 AAV 血清型多达 18 种 : 1-9、6.2、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、AAV2.7m8。

不同的血清型具有相似的结构和大小。然而，由于衣壳蛋白的结构不同，它们具有不同的嗜性。早期的 CNS AAV 研究使用的是自然血清型的第一代载体（AAV2）和第二代载体（AAV5 或 AAV8）。近十年中，第三代载体（AAV9）被确定在脑和脊髓中分布广泛，同时靶向神经元和星形细胞。与其他自然血清型不同，AAV9 在静脉注射后很容易穿过血脑屏障，具有微创治疗的前景。因此，AAV9 已成为 AAV 介导的中枢神经系统基因治疗的金标准[4] 。我们对 AAV9 进行了神经系统转导测试，效果如下：

载体家测试尾静脉注射 AAV9-CAG-EGFP 转导小鼠中枢神经系统效果。取出生 48 小时内的新生小鼠，体重约 1.5 g，静脉注射，注射剂量约 1 x 10^11 vg/g。10 天后处死取材，制备冰冻切片，激光共聚焦显微镜观察。

神经病毒传递方式

为了将病毒载体递送至 CNS，需要使用机械的或生物学的手段绕过 BBB 障碍。 BBB 由三层组成，它们将大脑、脊髓、脑脊液与血液分开，主要位于内皮细胞独特的紧密连接处。这些被称为脑毛细血管内皮层，脉络膜丛上皮和蛛网膜的层各由一层紧密连接的细胞组成。大型或疏水性分子，例如病毒、大型药物和许多蛋白质，通常无法被动地从血液中穿过血脑屏障进入大脑。

绕过 BBB 的机械方法包括直接向脑实质内立体定向注射，向 CSF 注射或改变 BBB 以允许血管内递送。生物学手段包括在肌肉内注射后利用经历逆行转运的载体来转导运动神经元，并且采用可以穿越完整血脑屏障的载体[5]。

血脑屏障和脑脊液

保罗 · 埃里希（Paul Ehrlich）于 1885 年描述了血脑屏障的概念，当时他观察到注入到血管系统中的染料被除脑外的所有器官迅速吸收。后来发现，注入脑脊液（Cerebrospinal fluid, CSF）的染料可自由进入神经组织，但不会进入大脑的血液供应[6] 。血脑屏障由三层组成，它们将大脑、脊髓、脑脊液与血液分开，主要位于内皮细胞独特的紧密连接处。这些被称为脑毛细血管内皮层，脉络膜丛上皮和蛛网膜的层各由一层紧密连接的细胞组成。大型或疏水性分子，例如病毒、大型药物和许多蛋白质，通常无法被动地从血液中穿过血脑屏障进入大脑[5] 。

中枢神经系统与神经元

神经系统可以分为两部分：中枢神经系统和周围神经系统（Peripheral nervous system，PNS）。我们的神经系统的主要功能是从感觉感受器向大脑和脊髓传导刺激，然后将冲动传导回身体其他部位。构成神经系统的细胞主要有两种类型：神经元（Neuron）和神经胶质细胞（Glial cell）。

人类神经系统中大约有一万亿个神经元。这些重要的细胞使神经系统内的交流得以实现。神经元的电传导非常好。这允许它们通过产生电信号非常迅速地传播到可能相距一定距离的细胞，从而对刺激做出反应。神经元分为三个基本部分：细胞体（Cell body）、树突（Dendrite）和轴突（Axon）。

细胞体是神经元的主体部分，细胞存活所需的关键器官位于细胞体内。

树突类似于天线从细胞主体向外突出。它们增加了可用于接收其他神经元信号的表面积。一个神经元有时可以具有多达 40万个树突。

轴突也被称为神经纤维。它是一种细长的管状结构，从细胞主体延伸到其他细胞。它传导远离神经元的电信号，称为动作电位（Action potential）。轴突的长度可以变化，范围从小于一毫米到大于一米。

除神经元外，神经胶质细胞是构成神经系统的另一种主要细胞类型。胶质细胞也称为神经胶质细胞，构成了 CNS 中约 90％的细胞。但是，它们仅占据大脑中大约一半的空间，因为它们不像神经元那样具有广泛的分支。与神经元不同，神经胶质细胞不传导神经电信号。相反，它们起到保护和滋养神经元的作用[6]。

中枢神经系统由大脑和脊髓构成。大脑是一个非常复杂的结构，但我们可以将其解剖结构划分为灰质（Grey matter）和白质（White matter）。灰质主要由神经元细胞体组成，细胞体是一个容纳神经元核的球形结构。大脑的白质区域主要由带鞘的轴突组成，由于鞘含有相对较高的脂肪含量而呈白色[7]。

神经特异性启动子

载体家不仅提供广泛表达启动子，如 CMV、EF1A、EFS、CAG、CBh 等，还能提供多种神经特异性启动子，帮助您高效构建 AAV 载体。

References

[1] Ingusci S, Verlengia G, Soukupova M, Zucchini S, Simonato M. Gene Therapy Tools for Brain Diseases. Front Pharmacol. 2019 Jul 1;10:724.

[2] Chamberlain K, Riyad JM, Weber T. Cardiac gene therapy with adeno-associaed virus-based vectors. Curr Opin Cardiol. 2017 May;32(3):275-282.

[3] Katz MG, Fargnoli AS, Weber T, Hajjar RJ, Bridges CR. Use of Adeno-Associated Virus Vector for Cardiac Gene Delivery in Large-Animal Surgical Models of Heart Failure. Hum Gene Ther Clin Dev. 2017 Sep;28(3):157-164.

[4] Lykken EA, Shyng C, Edwards RJ, Rozenberg A, Gray SJ. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. J Neurodev Disord. 2018 May 18;10(1):16.

[5] Gray SJ, Woodard KT, Samulski RJ. Viral vectors and delivery strategies for CNS gene therapy. Ther Deliv. 2010 Oct;1(4):517-34.

[6] Anatomy of the central nervous system (CNS, spinal Cord): MyVMC. (2019, May 6). https://healthengine.com.au/info/central-nervous-system-cns.

[7] Mackenzie, R. J. (2019, August 30). Gray Matter vs White Matter. Neuroscience from Technology Networks. https://www.technologynetworks.com/neuroscience/articles/gray-matter-vs-white-matter-322973.