- 移动端
云舟生物科技（广州）股份有限公司品牌商
8 年
手机商铺
商家活跃：
产品热度：
- NaN
- 0.5
- 1.5
- 0.5
- 3.5
公司新闻/正文
载体家小课堂 | 了解常用的神经特异性启动子
4286 人阅读发布时间：2022-01-21 09:39
基因治疗载体的表达盒包含特定的启动子元件以协助治疗性基因的表达，而启动子的选择对表达调控尤为重要。在基因治疗领域，通常需要控制递送的目的基因在特定组织或者细胞进行表达，同时不影响非靶向的组织，因此合理使用组织特异性启动子是获得治疗性基因良好表达效果的关键一步。
对于中枢神经系统的基因治疗研究，实现转基因的特异性表达可在三个层面操作[1]：
第一层是使用立体定位注射对特定脑区域注射基因治疗载体，但是这方式由于侵入性强而不大可能在近阶段的临床应用上普及；
第二层是利用特定病毒载体的神经嗜性，比如神经嗜性的AAV血清型，但是病毒衣壳在靶向特定神经细胞类型方面的能力相当有限，这是因为病毒载体难以被限制于只转导一种类型的神经细胞；
第三层则是从转录层面进行调控，即使用特异性启动子。这种方法通常与具有组织嗜性的病毒载体共同使用以进一步提高转基因表达的细胞特异性。实际上，相当多的特异性启动子序列是从细胞的特异性表达基因的上游调控区域获得的。这些启动子是否表现出转录活性与其所处的细胞类型密切相关。以下是云舟生物提供的神经特异性启动子的相关阐述。
Nes启动子
Nes启动子常用于在神经干细胞中特异性表达目的基因。Nes启动子来源于大鼠NES基因2号内含子上的调控序列与Hsp68启动子序列的整合。NES基因编码的巢蛋白（Nesting）是一种中间纤维蛋白，最初有作为神经上皮干细胞的标记蛋白的应用。NES的2号内含子序列被发现可作为增强子指导巢蛋白在神经前体细胞中特异表达。随着神经系统 的发育，神经干细胞发生分化，NES受调控表达下调，同时巢蛋白逐渐被其它细胞类型特异的中间纤维蛋白取代[2，3]。
Tuba1α启动子
Tuba1α启动子同样可用于神经前体细胞的目的基因特异性表达。Tuba1α启动子序列来源于大鼠T alpha 1基因启动子，该基因是α微管蛋白多基因家族中的一员，被认为对神经发育和神经再生具有调节作用。在小鼠中对T α1启动子的进一步研究确认了至少一段1.1kb长度的调控序列对于神经发育和再生时的T α1上调表达是必要的[4]。
Camk2α启动子
CAMK2即钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II），同时也是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以在谷氨酸能神经元中通过一系列下游级联反应调控突触上的谷氨酸受体活性，介导海马中的神经元之间的长时程增强（Long-term potentiation，LTP）或长时程抑制（Long-term depression，LTP）的现象形成。CAMK2α作为CAMK2的α亚基，被证明其表达对于海马中LTP和LTD的产生是必须的。早期在对LTP和LTD的研究中使用达8 kb长度的Camk2α启动子以实现突变型CAMK2在前脑区域表达，近年研究表明可使用较短的Camk2α启动子长度（~1.3 kb）获得良好的转基因表达效果[5，6，7]。
SYN1启动子
SYN1蛋白是突触蛋白（Synapsin）家族中的一员，该类蛋白在神经元细胞中特异表达，对轴突和突触的生成有重要作用。SYN1在轴突末端可以被多种蛋白激酶磷酸化，以调节其功能。人SYN1启动子是弱启动子，使用时通常需要在表达盒中加入WPRE增强转基因的表达效率。研究表明使用SYN1可以严格地将目的基因限制在海马、纹状体、丘脑、苍白球、黑质和皮质等区域进行表达[8，9]。
Hb9启动子
Hb9基因又称为运动神经元和胰腺同源框基因1（Motor Neuron And Pancreas Homeobox 1，MNX1），在发育中的CNS的运动神经中选择性表达，并且这种选择性表达是受Hb9增强子调控的。研究表明在人胚胎单细胞中激活Hb9的表达可以诱导分化并形成脊髓运动神经元。Hb9人工启动子来源于Hb9增强子上的一段保守序列与Hsp68启动子序列的整合[10，11，12]。
Th启动子
Th启动子常用于多巴胺能神经元的目的基因特异性表达。该启动子序列在天然状态下驱动酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）基因的表达。TH富集于CNS的儿茶酚胺能神经元，这其中包括有中脑的多巴胺能神经元和蓝斑核的正腎上腺素神经元。研究表明在小鼠胚胎干细胞中，通过调控Th启动子可以促进多巴胺能神经元的分化形成。在大鼠中转导以Th启动子驱动的目的基因可选择性地在中脑的多巴胺能神经元表达[13，14]。
NSE启动子
NSE即神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase），早期已发现只在高度分化的神经元和神经内分泌细胞中表达（Schmechel and Marangos, 1983）。1987年，Sakimura等人对大鼠NSE基因结构进行了初步分析，发现其5‘上游启动子区域包含类TATA序列、串联重复序列以及GC富集序列等特征。1995年，Sakimura等人进一步验证大鼠NSE基因启动子的功能，发现NSE启动子调控序列的存在是与NSE在神经元中特异性高水平表达相关的。而后人研究表明，使用1.8 kb的NSE启动子序列足以保证目的基因在神经细胞选择性表达[15，16，17]。
GFAP启动子
GFAP即胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein），是一种在星形胶质细胞高丰度表达的中间纤维蛋白，可作为星形胶质细胞的蛋白标记物。1994年，Brenner等人使用了GFAP的2.2 kb启动子实现在转基因小鼠的星形胶质细胞中选择性表达目的基因。后人进一步筛选GFAP启动子序列上的关键调控元件，获得了681 bp长度的短版本GFAP启动子[18，19]。
Iba1启动子
离子化钙结合衔接子分子-1（Ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBa1），通常称作同种异体移植炎症因子-1（Allograft inflammatory factor 1，AIF1），是在小胶质细胞中发现的特异性表达蛋白，并且在神经损伤后的激活的小胶质细胞中表达上调[20]。Hirasawa等人分离并使用了Iba1的启动子序列构建Iba1驱动EGFP表达的转基因小鼠，通过活体切片的方式实现了小鼠小胶质细胞的荧光标记[21]。
Prnp启动子
朊蛋白（Prion protein，PRNP）的高水平表达在遭受致死性神经退化疾病的脑组织中相当常见，且在海马、皮质、脊髓等区域均有分布。该蛋白包含五个不稳定的串联八肽重复序列结构，当其发生错误折叠时形成的蛋白聚集可导致克雅氏病与致死性家族性失眠的发生。Weber等人使用了小鼠PRNP基因的第一、二号外显子以及该基因上游6.2 kb的调控序列构筑了Prnp启动子，成功构建了以该启动子驱动Tamoxifen诱导的Cre-ERT重组酶在中枢神经系统特异性表达的转基因小鼠[22]。
第一层是使用立体定位注射对特定脑区域注射基因治疗载体，但是这方式由于侵入性强而不大可能在近阶段的临床应用上普及；
第二层是利用特定病毒载体的神经嗜性，比如神经嗜性的AAV血清型，但是病毒衣壳在靶向特定神经细胞类型方面的能力相当有限，这是因为病毒载体难以被限制于只转导一种类型的神经细胞；
第三层则是从转录层面进行调控，即使用特异性启动子。这种方法通常与具有组织嗜性的病毒载体共同使用以进一步提高转基因表达的细胞特异性。实际上，相当多的特异性启动子序列是从细胞的特异性表达基因的上游调控区域获得的。这些启动子是否表现出转录活性与其所处的细胞类型密切相关。以下是云舟生物提供的神经特异性启动子的相关阐述。
Nes启动子
Nes启动子常用于在神经干细胞中特异性表达目的基因。Nes启动子来源于大鼠NES基因2号内含子上的调控序列与Hsp68启动子序列的整合。NES基因编码的巢蛋白（Nesting）是一种中间纤维蛋白，最初有作为神经上皮干细胞的标记蛋白的应用。NES的2号内含子序列被发现可作为增强子指导巢蛋白在神经前体细胞中特异表达。随着神经系统 的发育，神经干细胞发生分化，NES受调控表达下调，同时巢蛋白逐渐被其它细胞类型特异的中间纤维蛋白取代[2，3]。
Tuba1α启动子
Tuba1α启动子同样可用于神经前体细胞的目的基因特异性表达。Tuba1α启动子序列来源于大鼠T alpha 1基因启动子，该基因是α微管蛋白多基因家族中的一员，被认为对神经发育和神经再生具有调节作用。在小鼠中对T α1启动子的进一步研究确认了至少一段1.1kb长度的调控序列对于神经发育和再生时的T α1上调表达是必要的[4]。
Camk2α启动子
CAMK2即钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II），同时也是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以在谷氨酸能神经元中通过一系列下游级联反应调控突触上的谷氨酸受体活性，介导海马中的神经元之间的长时程增强（Long-term potentiation，LTP）或长时程抑制（Long-term depression，LTP）的现象形成。CAMK2α作为CAMK2的α亚基，被证明其表达对于海马中LTP和LTD的产生是必须的。早期在对LTP和LTD的研究中使用达8 kb长度的Camk2α启动子以实现突变型CAMK2在前脑区域表达，近年研究表明可使用较短的Camk2α启动子长度（~1.3 kb）获得良好的转基因表达效果[5，6，7]。
SYN1启动子
SYN1蛋白是突触蛋白（Synapsin）家族中的一员，该类蛋白在神经元细胞中特异表达，对轴突和突触的生成有重要作用。SYN1在轴突末端可以被多种蛋白激酶磷酸化，以调节其功能。人SYN1启动子是弱启动子，使用时通常需要在表达盒中加入WPRE增强转基因的表达效率。研究表明使用SYN1可以严格地将目的基因限制在海马、纹状体、丘脑、苍白球、黑质和皮质等区域进行表达[8，9]。
Hb9启动子
Hb9基因又称为运动神经元和胰腺同源框基因1（Motor Neuron And Pancreas Homeobox 1，MNX1），在发育中的CNS的运动神经中选择性表达，并且这种选择性表达是受Hb9增强子调控的。研究表明在人胚胎单细胞中激活Hb9的表达可以诱导分化并形成脊髓运动神经元。Hb9人工启动子来源于Hb9增强子上的一段保守序列与Hsp68启动子序列的整合[10，11，12]。
Th启动子
Th启动子常用于多巴胺能神经元的目的基因特异性表达。该启动子序列在天然状态下驱动酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）基因的表达。TH富集于CNS的儿茶酚胺能神经元，这其中包括有中脑的多巴胺能神经元和蓝斑核的正腎上腺素神经元。研究表明在小鼠胚胎干细胞中，通过调控Th启动子可以促进多巴胺能神经元的分化形成。在大鼠中转导以Th启动子驱动的目的基因可选择性地在中脑的多巴胺能神经元表达[13，14]。
NSE启动子
NSE即神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase），早期已发现只在高度分化的神经元和神经内分泌细胞中表达（Schmechel and Marangos, 1983）。1987年，Sakimura等人对大鼠NSE基因结构进行了初步分析，发现其5‘上游启动子区域包含类TATA序列、串联重复序列以及GC富集序列等特征。1995年，Sakimura等人进一步验证大鼠NSE基因启动子的功能，发现NSE启动子调控序列的存在是与NSE在神经元中特异性高水平表达相关的。而后人研究表明，使用1.8 kb的NSE启动子序列足以保证目的基因在神经细胞选择性表达[15，16，17]。
GFAP启动子
GFAP即胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein），是一种在星形胶质细胞高丰度表达的中间纤维蛋白，可作为星形胶质细胞的蛋白标记物。1994年，Brenner等人使用了GFAP的2.2 kb启动子实现在转基因小鼠的星形胶质细胞中选择性表达目的基因。后人进一步筛选GFAP启动子序列上的关键调控元件，获得了681 bp长度的短版本GFAP启动子[18，19]。
Iba1启动子
离子化钙结合衔接子分子-1（Ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBa1），通常称作同种异体移植炎症因子-1（Allograft inflammatory factor 1，AIF1），是在小胶质细胞中发现的特异性表达蛋白，并且在神经损伤后的激活的小胶质细胞中表达上调[20]。Hirasawa等人分离并使用了Iba1的启动子序列构建Iba1驱动EGFP表达的转基因小鼠，通过活体切片的方式实现了小鼠小胶质细胞的荧光标记[21]。
Prnp启动子
朊蛋白（Prion protein，PRNP）的高水平表达在遭受致死性神经退化疾病的脑组织中相当常见，且在海马、皮质、脊髓等区域均有分布。该蛋白包含五个不稳定的串联八肽重复序列结构，当其发生错误折叠时形成的蛋白聚集可导致克雅氏病与致死性家族性失眠的发生。Weber等人使用了小鼠PRNP基因的第一、二号外显子以及该基因上游6.2 kb的调控序列构筑了Prnp启动子，成功构建了以该启动子驱动Tamoxifen诱导的Cre-ERT重组酶在中枢神经系统特异性表达的转基因小鼠[22]。
云舟生物载体线上设计平台
快速选择AAV载体特异性启动子
快速选择AAV载体特异性启动子
重组AAV病毒是近年来极为热门的基因治疗和疫苗开发的基因递送载体。云舟生物革命性的在线载体设计交易平台“载体家”，力求帮助研究者更便捷且高效地设计相关载体方案。在该平台，您可以无缝体验从载体图谱设计到病毒包装全流程，且无需下载任何付费软件。
此外，您还可以体验到：
丰富的载体元件库：包括启动子、ORF、shRNA和gRNA等在内的数百种载体元件，为您节省查找载体元件的时间与精力。
详细的载体注释：完成载体设计后线上任意查看该载体各个元件的详细描述和应用注释。
简易的订购流程：在线交易系统快速生成合同、下单并支付，就如同网购一样简单。
点击此处查看更多AAV载体设计信息。
点击此处查看更多AAV病毒包装信息。
参考文献：
[1] Manfredsson, Fredric P. Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. 2016.
[2] Lothian C, Lendahl U. Eur J Neurosci. 1997;9(3):452-462.
[3] Michalczyk K, Ziman M. Histol Histopathol. 2005;20(2):665-671.
[4] Gloster A, Wu W, Speelman A, et al. J Neurosci. 1994;14(12):7319-7330.
[5] Coultrap SJ, Freund RK, O'Leary H, et al. Cell Rep. 2014;6(3):431-437.
[6] Mayford M, Wang J, Kandel ER, O'Dell TJ. Cell. 1995;81(6):891-904.
[7] Dittgen T, Nimmerjahn A, Komai S, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101(52):18206-18211.
[8] Glover CP, Bienemann AS, Heywood DJ, Cosgrave AS, Uney JB. Mol Ther. 2002;5(5 Pt 1):509-516.
[9] Kügler S, Meyn L, Holzmüller H, et al. Mol Cell Neurosci. 2001;17(1):78-96.
[10] Nakano T, Windrem M, Zappavigna V, Goldman SA. Dev Biol. 2005;283(2):474-485.
[11] Peviani M, Kurosaki M, Terao M, et al. J Neurosci Methods. 2012;205(1):139-147.
[12] Singh Roy N, Nakano T, Xuing L, Kang J, Nedergaard M, Goldman SA. Exp Neurol. 2005;196(2):224-234.
[13] Yoshizaki T, Inaji M, Kouike H, et al. Neurosci Lett. 2004;363(1):33-37.
[14] Oh MS, Hong SJ, Huh Y, Kim KS. Gene Ther. 2009;16(3):437-440.
[15] Kirino T, Brightman MW, Oertel WH, Schmechel DE, Marangos PJ. J Neurosci. 1983;3(5):915-923.
[16] Sakimura K, Kushiya E, Ogura A, Kudo Y, Katagiri T, Takahashi Y. Brain Res Mol Brain Res. 1995;28(1):19-28.
[17] Twyman RM, Jones EA. J Mol Neurosci. 1997;8(1):63-73.
[18] Brenner M, Kisseberth WC, Su Y, Besnard F, Messing A. J Neurosci. 1994;14(3 Pt 1):1030-1037.
[19] Lee Y, Messing A, Su M, Brenner M. Glia. 2008;56(5):481-493.
[20] Ito D, Imai Y, Ohsawa K, Nakajima K, Fukuuchi Y, Kohsaka S. Brain Res Mol Brain Res. 1998;57(1):1-9.
[21] Hirasawa T, Ohsawa K, Imai Y, et al. J Neurosci Res. 2005;81(3):357-362.
[22] Weber P, Metzger D, Chambon P. Eur J Neurosci. 2001;14(11):1777-1783.
云舟生物科技（广州）有限公司
网址：www.vectorbuilder.cn
电话：020-28069042
邮箱：service@vectorbuilder.cn