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公司新闻/正文
带您了解CRISPRa与CRISPRi基因表达调控系统
2431 人阅读发布时间：2022-07-29 16:31
CRISPR/Cas9系统是当前流行的基因编辑工具之一。由于CRISPR/Cas9的构建更简易，超越了更早开发的ZFN和TALEN技术，使得该技术在当今基因编辑领域最为炙手可热。
Cas9属于RNA引导的DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抗性。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。在传统的CRISPR敲除实验中，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。
通过利用Cas9在gRNA引导下靶向特定DNA序列的生物学特点，科学家进一步开发出基于突变型Cas9（dead Cas9，dCas9）的基因靶向激活和基因靶向抑制工具，前者称之为CRISPR激活（CRISPR activation，CRISPRa），后者则称之为CRISPR抑制（CRISPR interference，CRISPRi）。在这两种系统中，dCas9是没有核酸酶活性的，这是通过向Cas9的RuvC和NHN两个核酸酶结构域分别引入氨基酸突变D10A和H840A实现的，但是dCas9本身仍保留结合DNA的能力。
CRISPRa基因激活
CRISPRa发挥作用需要在细胞中组装形成一个协同激活介体复合物（Synergistic Activation Mediator，SAM），该复合物通常需要用户向靶细胞引入3个组分：msgRNA表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。当这三种载体共转导细胞时，msgRNA募集MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64到gRNA靶位点，从而组装出有功能性的SAM复合物。 这些SAM复合物可通过VP64、p65和HSF1激活结构域之间的协同相互作用实现靶位点的强烈转录激活。CRISPRa应用在上调目的基因表达的能力方面具有以下优势：
不改变内源基因组背景
CRISPRa可以激活内源基因组靶位点的转录。与转基因和基因编辑技术不同，该技术方法不会涉及改变靶基因位点基因组序列。
独立的调控手段
使用CRISPRa进行转录激活并不需要预先了解目的基因的天然调控机理，但需要知道靶位点DNA序列的准确信息。
强烈激活
CRISPRa转录激活的基因通常得到非常高水平的表达。
云舟生物验证了基于慢病毒的CRISPRa系统的基因上调表达效果。
（A）SAM复合物示意图。首先向NIH3T3细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HSF1的慢病毒，进行抗性筛选。然后使用递送msgRNA的第三种慢病毒转导细胞，并用另一种抗生素进行筛选。
（B）针对靶向mBrn2基因启动子区域而设计的msgRNA。
（C） 通过qRT-PCR测量mBRn2的相对基因表达，量化了使用Scramble、msgRNA以及空白对照（NC）转导的并经过抗性筛选的NIH3T3细胞中mBrn2转录产物表达量。Mean±SD，*P<0.05，Turkey事后检验。
CRISPRi基因抑制
在CRISPRi应用中，dCas9融合了一个基因抑制结构域，比如KRAB（krüppel-associated box）结构域，此时这样的蛋白称之为dCas9-KRAB。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域（bipartite repressor domain）KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。对于一个完整的dCas9-KRAB CRISPRi载体系统包含两个部分，gRNA表达载体和dCas9-KRAB（或者dCas9-KRAB-MeCP2）表达载体。设计基因抑制实验时，只需要设计打靶目的基因的gRNA表达载体即可。相较于shRNA和CRISPR敲除，CRISPRi在下调目的基因表达的能力方面具有以下优势：
不改变内源基因组背景
与CRISPR基因编辑、传统基因敲除技术不同，dCas9-KRAB CRISPRi系统不会改变靶基因位点基因组序列。
强基因抑制效果
使用dCas9-KRAB CRISPRi系统进行转录抑制通常可以获得高水平的基因抑制效果。
更多适用的基因种类
由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达，因此适用于多种转录本，包括mRNA、非编码RNA、microRNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III转录本的转录抑制。
特异性
dCas9-KRAB CRISPRi系统可实现高效抑制同时，几乎没有脱靶现象。
云舟生物验证了基于慢病毒的CRISPRi基因抑制表达效果。
（A）转录阻遏复合物示意图。首先向Jurkat细胞转导携带dCas9:KRAB:MeCP2的慢病毒以表达转录阻遏复合物，然后进行抗性筛选。然后用另一种慢病毒转导细胞以表达scramble或者gRNA，并进行额外的抗性筛选。
（B） 靶向CXCR4基因启动子区的gRNA。
（C） 通过qRT-PCR测量CXCR4的相对基因表达，量化了使用scramble、gRNA以及空白对照（NC）转导的病经过抗性筛选的Jurkat细胞中CXCR4转录产物表达量。Mean±SD，***P<0.001，****P<0.0001，Tukey事后检验。
（D） 通过western blot证实了含有打靶gRNA的Jurkat细胞中的CXCR4表达水平下调。
