载体家小课堂 | T7EI酶切鉴定CRISPR基因编辑效果

基因编辑是一种对靶基因或转录产物进行敲除、插入和定点突变等精确修饰的基因工程技术，主要通过人工核酸酶实现对基因组的特定序列的敲除、插入或精确修饰。已有的三大基因编辑技术包括ZFN技术、TALEN技术以及CRISPR/Cas9 技术。相对于前两种技术，CRISPR/Cas9 技术切割效率相对较高且操作简单，并且可以同时进行多位点的编辑，是当前流行的基因组编辑工具。

往体外培养的细胞进行CRISPR/Cas9基因编辑时，为获得编辑结果一致的克隆群体，需要至少两次筛选。

首次筛选为判定基因编辑是否发生，然后第二次筛选为获得编辑后的单克隆细胞。对于初次筛选，一般可使用T7核酸内切酶I（T7 endonuclease I，T7EI）处理转染细胞的基因组进行鉴定，该方法被称为错配剪切法试验（Mismatch Cleavage Assay）。
 

如果CRISPR/Cas9编辑成功在DNA上引入突变，则可与野生型DNA片段退火产生异质双链DNA。T7EI可以识别该DNA上的不完全配对的DNA位点然后进行双链切割，因此通过琼脂糖凝胶电泳即可显示酶切后的条带，从而半定量判定基因编辑效果。需要注意的是，T7EI也可以识别DNA高级结构如十字型结构（Cruciform structure）、霍利迪连接体（Holiday junction）等并进行剪切，因此检测时应当加入阴性对照。

 
错配剪切法原理

错配剪切法包含以下四个实验步骤：
1.收集细胞并提取基因组DNA，然后使用PCR扩增期望编辑的基因组区域。扩增子的长度建议为0.5-1 kb。

2.对扩增的DNA进行变性和退火复性。扩增的DNA因此发生双链重新匹配，且当基因编辑发生时，将产生异质双链DNA。

 

错配剪切法电泳鉴定基因编辑效果
 

3.使用T7EI酶处理退火后DNA产物，37℃孵育15分钟。T7EI可以在双链DNA的错配位点处创建双链DNA切割。代表基因编辑成功的异质双链DNA将被切割。

4.T7EI酶切处理后的DNA跑琼脂糖凝胶电泳。如果出现了切割下来的DNA条带，则说明成功发生了基因编辑。通过对比样品间酶切后的DNA条带亮度，也能判断某个样品的基因编辑效率。

发生基因编辑的基因组序列可以进一步使用Sanger测序确认。在这种情况下，测序峰图如果出现重叠峰，则说明发生了基因编辑。如果需要精确读取突变信息，则需要进行二代测序。


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