载体家小课堂| 搞生物的总要看看吧：一文了解Cas9非病毒载体基因递送

CRISPR/Cas9技术是当前一种极为常用的基因编辑工具。该技术中，具备切割DNA能力的Cas9核酸酶可以与特定的向导RNA（gRNA）分子形成RNP复合物，通过gRNA与靶位点的互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后进一步切割基因组中的靶位点。

 

根据应用的不同，至今已经开发出的Cas核酸酶有多种类型，比如常用SpCas9以及SaCas9。SpCas9的序列来源于化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），是一种较大的Cas9蛋白，使用较为特异PAM序列（NGG）与靶DNA位点结合。SaCas9的序列则来源于某种球菌（Staphylococcus aureus），其分子量较小，适用于AAV等装载量小的病毒载体转导Cas9基因。SaCas9使用特异性较低的PAM序列（NNGRRT）识别DNA靶位点。
 

目前向细胞递送Cas9基因用于基因编辑有多种方式，然而对于基因治疗临床研究，为达到足够的安全性，更多人开始关注以下多种非病毒载体的转基因方法。

 

Cas9 质粒DNA

质粒DNA是一种十分常用的基因递送载体。制备质粒DNA成本低廉、操作简易，可以在大肠杆菌中扩增。传统质粒DNA在细胞中可以存在较长时间，但是由于存在易引发免疫反应的骨架序列比如复制起点、抗性基因等，并且有随机整合宿主基因组的可能，因此具有明显的安全性问题。

对于含有Cas9表达框的质粒DNA，其质粒总长已经较大，会带来明显的转染效率问题。当前通过删除质粒DNA中细菌来源的骨架序列，保留只携带真核表达元件ORF的表达框，然后通过体外酶合成制备微环DNA（Minicircle DNA）是一种更具可行性的应用方案。

 

Cas9 IVT mRNA

随着新冠mRNA疫苗在全球的成功推广，越来越多人认识到IVT mRNA在基因递送方面的应用潜力。IVT mRNA在体外以T7 RNA聚合酶从质粒DNA转录合成RNA分子，不含有任何细菌DNA序列，在体内具有更高的安全性。

在CRISPR系统中，使用IVT mRNA同样可以将Cas9基因导入靶细胞进行表达。Cas9 mRNA对比质粒系统还具有以下几点优势：

★  由于mRNA相比质粒DNA可以更快地翻译产生Cas9蛋白，并且其随后在较短的时间内降解，因此不像质粒DNA那样长期停留在细胞内转录表达Cas9，有利于减少了基因编辑中的脱靶效应。

★  作为RNA分子，Cas9 mRNA不会整合宿主基因组，极大减少了转导外源基因可能引发的插入突变以及基因组变化。

★  Cas9 mRNA在转染细胞的方式上可选择的方式更多，可以使用电转法、化学转染法、以及毒性更低的方法，比如利用LNP封装的mRNA。

★  经过序列优化的Cas9 mRNA接近真核生物细胞内的天然核酸分子，免疫原性更低，翻译表达出Cas9基因的效率高。

 

Cas9-gRNA RNP复合物

与以DNA/RNA为基础的递送技术相比，在细胞内表达Cas9蛋白也可以采用基于蛋白质的核糖核蛋白复合物（RNP）体系。RNP体系直接在体外将Cas9蛋白和gRNA组装形成RNP复合物，然后通过电转法等方式导入靶细胞，实现Cas9的瞬时表达。RNP体系的细胞毒性更低，半衰期更短（<48 h），采用其进行基因编辑可带来更低的脱靶效应。但是由于RNP在血液中易被蛋白酶降解，因此RNP介导的CRISPR基因编辑更多用于体外实验。

 

不同非病毒载体用于递送Cas9基因的比较

类型	质粒DNA	IVT mRNA	RNP
Cas9表达速度	低	中等	高
基因编辑效率	中-高	中等	中-高
分子稳定性	高	中等	中等
细胞中的表达时长	长时间	中等时长	短
免疫原性	高	中等	中等
细胞毒性	中等	低	低
插入突变风险	有风险	无	无
生产速度	快速	中等	低
使用成本	低	中等	高

 

云舟生物现货hSpCas9 IVT mRNA

云舟生物提供适用于体外和体内实验的现货人源化Cas9 mRNA产品。我们的mRNA以体外转录方式制备，可进行N1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰。经过试验验证，我们的hSpCas9 IVT mRNA可以高水平表达SpCas9并实现靶位点基因编辑。

云舟生物hSpCa9 IVT mRNA在体外的基因编辑效果

（A）向表达EGFP的HEK293T细胞转染打靶RGFP的gRNA以及经过N1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰的hSpCas9 IVT mRNA。（B）通过显微镜（100X）观察无转染的（NC）以及转染的两组细胞。（C）流式细胞术定量检测荧光强度。（D）转染后48或72 h，转染后的细胞相对NC减少了约40%的EGFP表达量。（E和F）基因编辑效果通过T7E1酶切（E）和Sanger测序确认（F）。高亮表示的腺嘌呤表明了在靶序列的插入突变。

参考文献

1. Ates I, Rathbone T, Stuart C, Bridges PH, Cottle RN. Delivery Approaches for Therapeutic Genome Editing and Challenges. Genes (Basel). 2020 Sep 23;11(10):1113.

2. Lin Y, Wagner E, Lächelt U. Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP. Biomater Sci. 2022 Mar 2;10(5):1166-1192.

3. Rouatbi N, McGlynn T, Al-Jamal KT. Pre-clinical non-viral vectors exploited for in vivo CRISPR/Cas9 gene editing: an overview. Biomater Sci. 2022 Jun 28;10(13):3410-3432.