载体家课堂 | 无肠腺病毒与DMD基因治疗

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD) 是一种上世纪80年代发现的X染色体隐性遗传病，至今仍缺乏有效的治愈手段。DMD在全球新生儿中的发病率约为1/3500-1/5000。该疾病由于编码抗肌萎缩蛋白（Dystrophin，Dys）的DMD基因的致病性突变导致Dys表达缺失，患者表现为肌肉无力和肌肉组织损失，并最终因呼吸衰竭死亡。DMD基因是人类基因组中已知的最大基因，在基因组上横跨约为2.4 MB的DNA，且需要约16小时才能转录完成。由于该基因较大，AAV和慢病毒等病毒载体系统无法装载整个基因用于治疗。

虽然AAV已经被用于探索DMD治疗方法，但是由于装载量的限制（AAV的两个ITR之间仅能携带4.7 kb的序列），这些疗法中只使用了非全长的微型版本的DMD基因。当前，使用微型DMD基因的AAV基因疗法治疗DMD仍处于不同的临床试验阶段，并且仍需要评估其治疗效果。AAV系统由于其很低的免疫原性以及很小的副作用在基因治疗中十分流行，但是使用更长版本的DMD基因的系统在临床上仍然值得进一步研究。

 

CRISPR基因编辑是另一种具备潜力的DMD基因治疗技术。使用这种方法可以对基因组突变进行矫正。目前也有临床前研究对该方法进行了探索，然而DMD可以是由不同的突变引起的，因此这种方法可能需要根据不同的基因突变进行优化。此外，目前的CRISPR/Cas9技术无法挽救DMD的某些突变状况。

无肠腺病毒

腺病毒载体是一种相当常用的基因递送系统，其病毒DNA在细胞中为游离体形式，且具有较大的装载量，可瞬时表达转基因。腺病毒载体作为基因递送工具在发展过程中已进行到了第三代，即无肠腺病毒（Gutless Adenovirus，GLAd），又称为辅助病毒依赖的腺病毒。该种腺病毒载体只保留了病毒本身的两端ITR序列和Ѱ包装信号，除了表达盒外其余病毒基因组序列均被stuffer DNA代替。Stuffer DNA有助于让整体腺病毒载体的大小接近野生型腺病毒基因组。这是因为当腺病毒载体的基因组大小相对野生型过小时，病毒颗粒的稳定性会受影响。

无肠腺病毒基因组（下）与第一代重组腺病毒基因组（上）比较

 

云舟生物的无肠腺病毒载体中的stuffer DNA使用的是人源的非编码序列，因此其随载体进入人体细胞不会产生显著的免疫原性，安全性更佳（早期的stuffer DNA使用非人源的如λ噬菌体DNA，注射后在细胞表面呈递λ噬菌体多肽，引发细胞毒性T淋巴细胞的免疫应答反应）。

 

GLAd与传统重组腺病毒的生产方法也略有不同，对于GLAd，需要使用线性化的质粒与包含floxed包装信号的辅助病毒共转染表达Cre重组酶的包装细胞。辅助病毒最后在细胞内因Cre重组反应失活，此时从细胞中裂解可以获得粗制的病毒颗粒，然后用于下一步扩增。

 

GLAd 目前被用于多种遗传疾病的基因治疗研究，包括亨廷顿舞蹈病和DMD。GLAd更大的装载能力使其成为十分有吸引力的基因治疗载体。GLAd对比腺病毒装载容量更大，可容纳33 kb的转基因DNA。而与AAV系统相比，GLAd的装载能力已足以容纳两条DMD基因的成熟mRNA分子（14 kb）。事实上，McGill大学的研究人员早前已尝试了在肌营养不良小鼠模型中利用GLAd载体较为长期地表达了鼠Dys蛋白，并观察到了显著的治疗效果。尽管转导的DMD基因最终在动物体内发生了丢失，持续优化该基因递送系统将为治愈DMD患者带来更多的可能性。