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公司新闻/正文
病毒包装滴度低？为您总结以下原因
1594 人阅读发布时间：2023-08-01 10:17
利用病毒载体是一种高效的将外源遗传信息递送入靶细胞的方法。制备重组病毒载体通常需要在大肠杆菌中扩增携带目的基因的质粒DNA，然后将这些质粒DNA转染包装细胞。重组病毒从这些包装细胞中产生，然后经过分离纯化、浓缩等步骤获得病毒原液。
然而正如多数分子生物学实验结果显示，这些复杂的实验步骤增加了实验的难度。病毒包装实验通常会因为载体设计、转染步骤、以及转基因毒性等步骤发生问题而导致失败。在此我们总结了一些相应的实验原因以帮助您在病毒包装时尽可能获得高滴度的病毒。
滴度检测差异
从包装细胞分离出病毒后，需要检测病毒滴度以确定病毒产量。该步骤对于高效转导靶细胞是不可或缺的。检测病毒滴度有多种方式，而确定使用何种方法则需要根据实际情景考虑。一个常见的问题是，该种病毒是需要测定物理滴度（物理数量）还是功能滴度（生物功能水平），还是两种均测定。不同类型的病毒可使用不同的方法检测。下表给出了常见的几种病毒的滴度测定方法。
每种滴度检测方法都有其优缺点，使用哪一种方法与可利用的实验资源有关。滴度检测结果产生差异也是很常见的现象，这是因为不同的方法、模型、试剂以及设备均有可能带来不同的测定结果。此外，病毒降解后也会导致滴度降低。
检查载体问题
病毒包装滴度低也可能是上游多个实验步骤发生了问题导致的。对此，首先您需要保证您的载体设计是正确的：比如当克隆至载体的转基因超出了载体骨架推荐的容量限制，又或者包含一段横跨数百或者更多碱基的高GC含量（>70% GC%）序列，都会降低病毒滴度。对于AAV载体，其反向末端重复序列（ITR）是一种GC富集序列。当ITR发生序列错误时将直接影响其复制，从而最终影响病毒滴度。保证ITR完整性是AAV病毒包装获得高滴度的重要因素。
此外，研究者还需要保证自己使用了合适的包装辅助质粒和包装细胞。比如，二代慢病毒的转移质粒载体不可被用于三代慢病毒包装体系。其次，包装细胞必须可以被转移质粒和其它辅助质粒有效转染。当细胞表现出衰老化时，会降低转染效率，从而最终导致病毒包装滴度变低。病毒的最后收集步骤也是重要的一步：需要保证在合适的时间点和条件下收集病毒（考虑收集上清、细胞沉淀、以及两者均收集）。
毒性基因
当排查上述因素后，如果病毒滴度仍然偏低，请考虑载体所携带的转基因的毒性影响。实际上，目前已知有相当一部分基因是对包装细胞有毒性的：比如促凋亡类型的基因Bax和GSDME、细胞周期调节因子类型的基因BABAM2和NEK1、以及与细胞增殖调控相关的基因FRL1和Foxn1。多项研究表明，当这些基因克隆至转移载体时并转染相应的包装细胞，病毒包装实验会因为细胞毒性而不能获得高滴度的病毒（McClean et al., 2009 & Janus et al., 2020）。需要注意的是，仍然有其它类型的基因陆续被发现会减少病毒量，比如应用于CRISPRa系统中的p65/HSF1基因。
如果必须使用有毒性的基因，一个最直接的改善方式是更换使用强度更弱启动子。下表展示了不同强度启动子条件下包装含有Foxn1基因的AAV病毒。数据表明，使用强度更弱的启动子可以增加病毒产量，使其达到了采用同等启动子的EGFP转基因的病毒包装效果。
此外，也可以运用诱导型或者组织特异性启动子让转基因在包装细胞中维持低的表达水平。如果在转移质粒中的携带强启动子是必须的，则可以通过改造包装细胞来抑制转基因在包装细胞中的活性。对于shRNA载体，一种常用的方法是通过在包装细胞中抑制DICER的活性降低shRNA的活性。这样的方式多种多样，比如说将毒性基因分解成多个片段克隆至转移质粒，并且特别适用于在AAV中克隆大片段的转基因。该方法需要精心设计载体，一般在没有其它方法可用时才使用。
病毒载体的优势在于可以更容易地对多种类型的细胞进行基因递送，然而对于不同的应用和靶细胞，研究者要取得足够高的病毒滴度仍然有困难的地方。除了提及的合适的载体设计和优化转染条件，调整转移载体上的启动子类型或者包装细胞中的下游靶点则常被用于减少毒性基因的影响。云舟生物对于病毒载体的设计的每一个关键步骤均有丰富的实践经验。下表展示了我们已发现容易导致低病毒滴度的基因类型。对于这些基因的病毒包装，建议采用特殊的或诱导型启动子。
【参考文献】
然而正如多数分子生物学实验结果显示，这些复杂的实验步骤增加了实验的难度。病毒包装实验通常会因为载体设计、转染步骤、以及转基因毒性等步骤发生问题而导致失败。在此我们总结了一些相应的实验原因以帮助您在病毒包装时尽可能获得高滴度的病毒。
滴度检测差异
从包装细胞分离出病毒后，需要检测病毒滴度以确定病毒产量。该步骤对于高效转导靶细胞是不可或缺的。检测病毒滴度有多种方式，而确定使用何种方法则需要根据实际情景考虑。一个常见的问题是，该种病毒是需要测定物理滴度（物理数量）还是功能滴度（生物功能水平），还是两种均测定。不同类型的病毒可使用不同的方法检测。下表给出了常见的几种病毒的滴度测定方法。
每种滴度检测方法都有其优缺点，使用哪一种方法与可利用的实验资源有关。滴度检测结果产生差异也是很常见的现象，这是因为不同的方法、模型、试剂以及设备均有可能带来不同的测定结果。此外，病毒降解后也会导致滴度降低。
检查载体问题
病毒包装滴度低也可能是上游多个实验步骤发生了问题导致的。对此，首先您需要保证您的载体设计是正确的：比如当克隆至载体的转基因超出了载体骨架推荐的容量限制，又或者包含一段横跨数百或者更多碱基的高GC含量（>70% GC%）序列，都会降低病毒滴度。对于AAV载体，其反向末端重复序列（ITR）是一种GC富集序列。当ITR发生序列错误时将直接影响其复制，从而最终影响病毒滴度。保证ITR完整性是AAV病毒包装获得高滴度的重要因素。
此外，研究者还需要保证自己使用了合适的包装辅助质粒和包装细胞。比如，二代慢病毒的转移质粒载体不可被用于三代慢病毒包装体系。其次，包装细胞必须可以被转移质粒和其它辅助质粒有效转染。当细胞表现出衰老化时，会降低转染效率，从而最终导致病毒包装滴度变低。病毒的最后收集步骤也是重要的一步：需要保证在合适的时间点和条件下收集病毒（考虑收集上清、细胞沉淀、以及两者均收集）。
毒性基因
当排查上述因素后，如果病毒滴度仍然偏低，请考虑载体所携带的转基因的毒性影响。实际上，目前已知有相当一部分基因是对包装细胞有毒性的：比如促凋亡类型的基因Bax和GSDME、细胞周期调节因子类型的基因BABAM2和NEK1、以及与细胞增殖调控相关的基因FRL1和Foxn1。多项研究表明，当这些基因克隆至转移载体时并转染相应的包装细胞，病毒包装实验会因为细胞毒性而不能获得高滴度的病毒（McClean et al., 2009 & Janus et al., 2020）。需要注意的是，仍然有其它类型的基因陆续被发现会减少病毒量，比如应用于CRISPRa系统中的p65/HSF1基因。
如果必须使用有毒性的基因，一个最直接的改善方式是更换使用强度更弱启动子。下表展示了不同强度启动子条件下包装含有Foxn1基因的AAV病毒。数据表明，使用强度更弱的启动子可以增加病毒产量，使其达到了采用同等启动子的EGFP转基因的病毒包装效果。
此外，也可以运用诱导型或者组织特异性启动子让转基因在包装细胞中维持低的表达水平。如果在转移质粒中的携带强启动子是必须的，则可以通过改造包装细胞来抑制转基因在包装细胞中的活性。对于shRNA载体，一种常用的方法是通过在包装细胞中抑制DICER的活性降低shRNA的活性。这样的方式多种多样，比如说将毒性基因分解成多个片段克隆至转移质粒，并且特别适用于在AAV中克隆大片段的转基因。该方法需要精心设计载体，一般在没有其它方法可用时才使用。
病毒载体的优势在于可以更容易地对多种类型的细胞进行基因递送，然而对于不同的应用和靶细胞，研究者要取得足够高的病毒滴度仍然有困难的地方。除了提及的合适的载体设计和优化转染条件，调整转移载体上的启动子类型或者包装细胞中的下游靶点则常被用于减少毒性基因的影响。云舟生物对于病毒载体的设计的每一个关键步骤均有丰富的实践经验。下表展示了我们已发现容易导致低病毒滴度的基因类型。对于这些基因的病毒包装，建议采用特殊的或诱导型启动子。
【参考文献】
1. Janus P, Toma-Jonik A, Vydra N, et al. Pro-death signaling of cytoprotective heat shock factor 1: upregulation of NOXA leading to apoptosis in heat-sensitive cells. Cell Death Differ. 2020;27(7):2280-2292.
2. McLean JE, Datan E, Matassov D, Zakeri ZF. Lack of Bax prevents influenza A virus-induced apoptosis and causes diminished viral replication. J Virol. 2009;83(16):8233-8246.
3. Sena-Esteves M, Gao G. Titration of Lentivirus Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(4):10.1101/pdb.prot095695.
4. Tiscornia G, Singer O, Verma IM. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 2006;1(1):241-245.
5. Wang F, Cui X, Wang M, Xiao W, Xu R. A reliable and feasible qPCR strategy for titrating AAV vectors. Med Sci Monit Basic Res. 2013;19:187-193. Weaver LS, Kadan MJ. Evaluation of adenoviral vectors by flow cytometry. Methods. 2000;21(3):297-312.
