载体家课堂 | 如何选择病毒载体？为您整理科研思路

选择病毒还是非病毒载体，很大程度上取决于您需要基因递送的靶细胞。传统的非病毒转染方法包括电穿孔、将质粒直接注射到细胞中或使用转染试剂，但这些策略通常局限于体外应用，只能转染少数类型细胞，满足较小的实验规模。
 

对于分化细胞，如果细胞生理发生改变，如细胞骨架变化、增殖减少和核酸酶增加等，都将导致细胞难以被转染。当今更前沿的转染方法是利用脂质纳米颗粒 （LNP）封装质粒或mRNA进行基因递送。该技术在COVID-19的mRNA疫苗得以应用，并在其他疗法中显示出巨大的前景。但是该方法也存在如难以靶向特定组织、性质不稳定以及递送的遗传物质半衰期时间短等局限性问题。
 

对于难转染的细胞类型，特别是体内系统，或者需要长时间表达转基因的实验，病毒载体则是相较非病毒载体更佳的选择。病毒载体类型众多，根据您的具体应用、外源基因大小、转导细胞类型适用于不同的病毒载体。

 

转基因永-久性表达
 

您还需要考虑是否需要永-久性表达转基因。具有整合能力的病毒系统可用于永-久性表达，其中包括慢病毒和γ逆转录病毒系统。
 

慢病毒因其广泛的组织嗜性以及感染分裂和非分裂细胞的能力而成为基础研究和临床应用中经常被使用的病毒系统。慢病毒也可被用于基因治疗：FDA最近批准的β地中海贫血治疗药物Zynteglo即是以慢病毒系统为基础设计的。
 

我们的γ逆转录病毒系统包括MMLV（莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒）和MSCV（鼠干细胞病毒）。这些病毒有着一定的局限性，但其仍在某些应用领域较为流行。这两类是可以在分裂细胞中将外源基因整合宿主基因组的病毒类型，但是病毒滴度相对较低，且分别只能插入小于5.5 kb （MMLV）和6.1 kb（MSCV）的转基因，而慢病毒载体的容量则为6.4 kb。此外，MMLV和MSCV的转基因是通过病毒启动子驱动表达的，尽管一些进一步改造的MMLV（自失活MMLV）可以使用自定义启动子。在用途上，MMLV可用于制备iPSC，而MSCV适用于转导造血干细胞（Hematopoietic stem cell, HSC）。



选择非整合型病毒
 

然而也有相当多的实验和应用不需要外源基因稳定整合宿主基因组。非整合型的病毒可以在细胞内以额外染色质或者游离体DNA的形式维持其遗传物质的存在。当转导的细胞分裂时，这些病毒的基因组则会随时间发展而被稀释。若靶细胞是完全分化的或者实验仅需要短期表达，则可以采用该类病毒。

 

腺病毒（AdV）和腺相关病毒（AAV）是两种常用的非整合型病毒。这两种病毒均能感染分裂或非分裂细胞，但是它们之间亦有许多不同点。值得注意的是，这些病毒系统当前仍在不断被研究，以求增强进一步提高其性能并克服原有的不足之处。例如，对腺病毒的修饰（嵌合Ad5/F35腺病毒）可以拓展其组织嗜性的范围，又或可以增强其装载能力（无肠腺病毒）。对于AAV，主要的改进点在于开发新型血清型以增强其组织嗜性的特异程度并提高转基因表达能力。

 

如果您考虑在科研级别上更进一步需要使用GMP-like和GMP等级的病毒载体，则无论是采用慢病毒抑或AAV均需要考虑在生产体系上采用相应等级的物料。当前，云舟生物可提供对应等级的现货病毒包装辅助载体，对于慢病毒有VSV-G、VB-Rev以及Gag/Pol，对于AAV则有-AAV2-Rep/Cap、AAV9-Rep/Cap以及AAV-Helper。这些辅助载体经过优化与验证，可以包装出高产量的病毒，并且满足无抗生素、无动物源等标准，可用于基因与细胞疗法开发中的临床前/临床阶段的病毒载体生产。

除了以上的选择外，还有一些病毒系统在疫苗和溶瘤疗法开发中颇具吸引力。水疱性口炎病毒（VSV）、单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VACV）是三种具有大装载能力的病毒载体，分别可装载约11、30、150 kb的转基因。此外，这些病毒均具有显著的免疫原性，因此作为疫苗载体具备相当的应用潜力。

 

虽然VSV传统上被用于研究病毒侵入机制，但近年来重组VSV被用于疫苗研制引起了更广泛的兴趣。VACV用作痘苗疫苗已经存在相当长的历史，其中已有多种减毒毒株、溶瘤毒株以及具有疫苗应用前景的毒株类型。类似地，具备强神经嗜好性的HSV传统上被用于多种神经系统研究，而如今也被拓展至肿瘤和疫苗等研究领域。

 

对于诸如VACV和HSV等大基因组病毒，其基因组克隆一直是一个较为困难的实验。云舟生物通过结合细菌人工染色体（BAC）和酵母人工染色体（YAC）的关键元件，创造性地合成了既可在大肠杆菌也可以在酿酒酵母中复制的BACYAC载体骨架，可灵活且高效地克隆HSV和VACV基因组序列。
 

 

云舟生物VACV BACYAC载体

病毒载体还可以结合许多应用系统，包括诱导型表达、条件性表达、以及基因编辑等工具。根据您的实验需求、靶细胞、插入基因大小，请选择最高效且最合适的病毒载体。下图总结了这些常用的病毒系统的特点。








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