一文了解“跳跃基因”——转座子

在20世纪60年代，科学家们观察到植物染色体上遗传元件的移动现象。这些遗传元件被称为转座元件或转座子，后来在病毒到哺乳动物等各种生物中也有所发现。

 

随着分子生物学的飞速发展，科学家们不仅对转座子进行了深入研究，为了将遗传物质引入宿主细胞基因组还对其进行了改造利用。这些研究成果不仅丰富了我们对生命科学的理解，也为基因编辑和基因治疗等领域的发展提供了重要的理论基础。

 

DNA转座子机制

DNA转座子的分子机制可以概括为转座酶表达、移动、插入三个阶段。在自然界中，DNA转座子以转座酶的形式存在，其编码序列两端具有末端重复序列（TR）。这种转座酶可在TR位点和基因组位点引入双链断裂，从而使整个转座子区域发生转位。转座酶的持续表达促进了持续的转位发生。对于基因递送应用，可以将转座酶组分进行剥离，同时将要插入基因组的基因序列置于TR之间（图1）。

图1 自然界的转座子经过改造，被拆分为多个质粒载体元件用于设计基因递送系统

 

 

选择转座子系统

如果您需要使用非病毒载体系统实现整合型表达，有多个转座子系统可供选择：piggyBac、睡美人（Sleeping Beauty）和Tol2。这些系统在使用上有着一定的共同点：

1. 包含GOI（以及相关的启动子、polyA尾巴序列等）的转座子质粒载体，其两侧为末端重复序列（TR）。

2. 使用相应的转座酶。转座酶以辅助质粒或mRNA方式提供，或者通过稳定表达转座酶的细胞/动物系提供。

注意：只有转座酶和转座子互相匹配才能用于高效的基因组整合，以piggyBac转座酶（PBase）为例，其不能有效作用于睡美人转座子载体或Tol2转座子载体。

 

 

PiggyBac系统

PiggyBac是受欢迎的转座子系统之一，可用于递送转基因、shRNA、重组抗体等。该系统还可以与其他方法（如CRISPR/Cas9基因编辑）相结合。piggyBac载体的优势在于大装载量，可以在5’和3’ TR之间携带长达27 kb的DNA。PiggyBac转座子介导基因整合时会在染色体TTAA位点切割DNA，并且优先选择基因内区域。

 

自发现piggyBac系统以来，人们对piggyBac转座子和转座酶进行了多处优化：转座子序列自身被截断，且转座酶经过了密码子优化和突变处理以增强转座效率。

 

原始的转座酶PBase与睡美人或Tol2转座酶相比具有更高的效率，但经过进一步修改的hyPBase能够提高15倍的转座效率。此外，经过进一步修改的hyPBase具有剪切活性但是整合活性缺失，这将确保整合的序列被移除后不会重新插入，实现无痕剪切。需要注意的是，hyPBase目前受专利保护，因此在用于构建商业载体时，应遵循相关法规进行使用。

 

 

睡美人系统

睡美人（Sleeping Beauty）也一种十分受欢迎的转座子系统，特别是在临床应用领域比如开发CAR-T细胞疗法，因为它倾向于随机整合并依赖于一个TA双核苷酸切割位点。与piggyBac系统类似，睡美人系统也使用一种高效的转座酶，且已被修改为超活性变体（SB100X）。然而与hyPBase相比，SB100X在大多数类型细胞中的效率较低。睡美人载体的装载容量较小，约为8 kb，并且在切割后会留下CAG印记。

 

Tol2系统

由于To2系统无序列偏好性，并倾向于整合到更灵活的基因组区域，该系统常用于动物品系的建立。Tol2系统的装载能力中等，为11 kb，转座酶效率高，但是低于piggyBac或睡美人转座酶。由于Tol2的转座效率在鱼类模型中的活性很高，历史上一直是创建斑马鱼品系的系统。下表对piggyBac、睡美人、To2载体系统进行了总结：

尽管三种转座子系统的应用都受限于靶细胞类型，睡美人系统则可以与包含HSV和腺病毒在内的病毒载体系统结合使用，以增强其对细胞的靶向性，同时保留了转基因整合能力。

 

 

转座子系统实验问题

正如其它基因递送实验一样具有风险，开展转座子实验需要进行仔细的计划并注意设置控制组。由于使用了多种成分，因此存在多种变量，阴性对照尤为重要。

 

以体外实验为例，应设置与实验组平行的仅转染转座子载体的阴性对照，并且两者都应进行细胞传代，直至转基因表达从阴性对照中消失，而这将表明转基因仅存在于发生转座的细胞中。可以通过反向PCR或连接介导的PCR来扩增基因组DNA与转座子交界的区域，从而确认转基因在宿主基因组中的位置。

 

当转座效率较低时，问题可能来源于转座子载体或者转座酶。检查的第一步也是最简单的一步是检查转座子载体和转座酶的比例。

 

对于使用PBase的piggyBac系统，我们建议从1:1的比例开始。增加转座酶的浓度可能会提高整合效率，但也可能带来更显著的基因毒性。实际上，增加转座子载体的浓度更有可能提高转座效率。

 

此外，通过使用设计更紧凑、剔除了细菌骨架成分的微环DNA载体也可以提高转座效率。这类载体相对于普通质粒载体具有更强效的转基因表达，而且也排除了细菌成分整合基因组的风险。

 

转座酶的递送方式也会影响转座效率和整合稳定性。质粒载体和IVT mRNA是两种最常用的转座酶递送体系。虽然质粒载体可能具有更高的表达效率，但是存在转座酶长期表达以及转座酶整合基因组的风险。在这种情况下，转座酶的持续活表达可能导致转座子的切除和再整合，从而可能破坏宿主基因。使用转座酶mRNA虽然表达效率可能下降，但是由于是短期表达，具有更高的安全性。

 

 

参考文献

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