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针对不同的递送系统选择启动子——基因高效表达的钥匙
1671 人阅读发布时间：2024-12-19 09:13
启动子的选择是设计基因递送载体时需要考虑的关键因素之一。一个理想的启动子需要确保目的基因（GOI）在靶组织或细胞中以期望的水平表达。根据研究目标，可以考虑使用组成型、组织特异性、广泛性、可诱导型、病毒类型的或非病毒启动子来驱动GOI的表达。
研究人员选择广泛性启动子通常期望在各种细胞类型中都能获得一致的基因表达效果。本文将介绍多种常用的广泛性启动子，并提供了将它们纳入载体设计以实现成功基因递送的相关指导。
广泛启动子选择的基本考量
选择广泛性启动子用于基因表达需要平衡三个主要因素：启动子的强度、长度和目的基因的期望表达水平。决定使用哪一种强度的启动子通常需要根据生物学问题、组织或细胞类型、以及期望的表达水平来指导。强启动子，包括CMV、CAG、CBh和EF1α，能够驱动高水平的转录，并在需要生产大量蛋白质时使用。然而，当需要GOI表达量较低的、生理水平的，中等强度的启动子时，PGK、SV40、MSCV或EFS更受青睐，因为它们能在多种细胞类型中提供稳定、适度的表达。
启动子的长度是另一个需要考虑的重要因素，这通常会受到载体的装载能力的影响。如果目的基因较长而载体的装载能力有限，那么可以使用较短（通常强度较弱）的启动子。相反，如果目的基因较短，那么可以使用较长的、强度更高的启动子。例如在AAV系统中，其装载能力有限，约为4.7 kb。如果需要插入的目的基因较长，推荐使用中等强度的EFS启动子（232 bp）以适应装载空间。因此，为特定的表达系统选择合适的启动子，是在载体的装载能力、目的基因的长度和期望的基因表达水平之间进行微妙平衡的结果。
一些备受欢迎的广泛性启动子均具有病毒和非病毒来源。CMV由于其小尺寸（589 bp）以及能在多种细胞类型中驱动高水平的基因表达，因此成为其中一种最常使用的广泛性病毒启动子。虽然CMV启动子对于目的基因高水平表达特别有效，尤其是在体外研究中，但需要注意的是，在某些细胞类型中，比如干细胞，CMV启动子容易随时间而被沉默。非病毒启动子，比如那些来源于广泛表达的基因，如EF1α，提供了更稳定的且接近生理水平的表达效果，因此特别适合长期表达和体内应用。此外，与CMV相比，EF1α不太容易被沉默，使其在需要避免启动子沉默或预期CMV会沉默的实验中更为合适。
针对不同的递送系统选择启动子
鉴于启动子的选择取决于您的特定的表达系统、应用和实验设置，以下是一些从我们多年基因递送经验中总结的设计要点，以帮助您选择正确的广泛性启动子。
（1）为病毒基因递送系统选择启动子：在使用病毒载体进行基因递送时，选择合适的启动子对于确保病毒包装的成功和目的基因的表达至关重要。对于AAV载体，由于CMV启动子在体外对各种细胞类型中可提供强效、持续的目的基因表达，因此被广泛使用。然而，我们观察到AAV在体内应用时CMV启动子通常会被沉默，表明CMV启动子可能被宿主系统识别为病毒组分。因此，对于AAV体内应用，更倾向于使用包括CAG（1733 bp）、CBh（798 bp）和EF1α（1178 bp）在内的其他强启动子以实现广泛表达。
在慢病毒载体中，CAG启动子具有显著的限制，这是因为其高GC含量可能不利于病毒包装获得较高的滴度。因此，在慢病毒载体中，更推荐使用CMV和EF1α启动子。设计慢病毒载体时另一个重要的考虑因素是避免为多个表达盒使用相同的启动子。两个相同的启动子容易在慢病毒载体中发生同源重组，导致它们之间基因发生序列缺失。因此，建议使用不同的启动子来驱动多个基因的表达，或者在多顺反子设计中使用像IRES或2A这样的连接子表达多个基因，以降低发生序列重组的风险。
（2）为您的表达对象（目的基因vs标记基因）选择启动子：在设计含有转基因和标记基因的载体时，为每个开放阅读框选择正确的启动子至关重要。对于目的基因，通常希望进行高水平的表达，因此像CMV或CBh这样的强启动子经常被使用。如果转基因的表达还需要增强子、沉默子和其他调控元件，而所有这些都需要适应载体的装载容量，则较小的启动子更为理想。对于标记基因，其主要用于识别或筛选阳性转染/转导的细胞，适度的表达通常是足够的。由于标记基因必须在广泛的靶细胞类型中表达，并且是更大的载体骨架的一部分，可以使用较小的、中等强度的启动子以节省空间占用并提供稳定、适度的基因表达。
（3）选择启动子以表达毒性基因：使用强启动子驱动基因表达并不总是合适的，因为它可能导致细胞毒性或其他不良生理影响。例如，在慢病毒载体中，Gag和Pol基因对于病毒颗粒的产生是必不可少的，但当Gag高水平表达时，会导致过多病毒颗粒形成，消耗细胞资源；而Pol的过度表达会干扰细胞DNA复制和修复，导致基因组不稳定。此外，像Myc这样的原癌基因的过度表达会驱动不受控制的细胞增殖并触发细胞压力途径，导致细胞死亡。因此，在克隆毒性基因时，倾向于使用较弱的启动子；实际上我们发现使用中等强度启动子驱动小鼠Foxn1（一种与细胞增殖调节相关的基因）表达的慢病毒载体比使用强启动子的相同载体进行包装可以获得高十倍的滴度。
(4) 选择启动子以表达小非编码RNA：诸如U6和H1这样的Pol III启动子常用于在基因敲低/敲除系统中表达gRNA或shRNA。Pol III专门负责转录小非编码RNA，这些RNA通常较短且缺乏mRNA的稳定性、核输出信号和翻译所需的5'帽和3' polyA尾巴。Pol III是小非编码RNA表达的合适启动子，但不适用于蛋白质编码基因的表达。
参考文献
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