CRISPR-Cas9系统设计与载体优化的黄金法则

*对于Cas9切刻酶、引导编辑器、dCas9以及碱基编辑器、PAM序列通常源于基本的SpCas9系统（NGG）

根据应用和研究问题的不同，CRISPR-Cas9系统可以以反向遗传学的方式使用，该方法侧重于基因功能的研究或调控。另一方面，CRISPR-Cas9系统也可以用于制备gRNA文库，以正向遗传学的方式进行大规模基因功能筛选。通过设计靶向基因组中每个基因或特定基因集合的gRNA，可以筛选并识别与表型、通路或疾病相关的基因。

设计高效的CRISPR载体

优化CRISPR实验对于实现成功且可重复的结果至关重要，涉及选择正确的Cas9版本、目标区域、gRNA和递送方法等方面。根据我们多年的基因递送经验，以下的实用技巧可帮助您完成一个高效的CRISPR载体设计：

1. 靶位点选择：靶位点的选择取决于实验目的和应用。对于基因敲除或敲入，通常选择蛋白质编码区域（外显子）作为靶位点。对于基因调控研究，非编码调控区域（启动子、增强子、内含子等）可用作靶位点。

2. Cas9选择：选择使用哪一种Cas9会是一个关键的决定，这将确保酶的功能符合其应用目的。这种选择需要参照您的实验目的和所使用的载体系统（见上表）。

3. gRNA选择，单gRNA/双gRNA：在大多数情况下，对于简单的基因敲除，一个正确的Cas9配对单gRNA就能产生所需的表型。而对于以下的特定情况，双gRNA是更好的选择：

（1）当使用Cas9_D10A切刻酶靶向单一位点相对的两条DNA链时，需要两个gRNA共同产生DSB以减少脱靶效应；

（2）在靶位点上创建DSB并删除DSB之间的DNA片段，该DSB的创建需要一对gRNA；

（3）同时靶向两个不同的基因。

4. PAM和gRNA的兼容性：gRNA和PAM序列的选择取决于所选的Cas9版本，因为每个Cas9都需要识别特定的PAM序列。选择一个合适的PAM序列对于gRNA有效打靶和最小化脱靶效应是至关重要的。

5. CRISPR载体选择，All-in-one载体与分离的单独载体：使用CRISPR系统要实现成功的基因编辑，靶细胞必须共表达Cas9和gRNA。递送这两个组分可以使用All-in-one载体一起递送，也可以使用两个单独的载体分别递送。

All-in-one载体在一个步骤中即可递送所有必要的组分，简化了CRISPR载体的使用，有利于各组分高效的共表达。相比之下，使用分离的单独载体需要共转导，这在实验操作上更具有挑战性，因为实际转导时，一些细胞可能只接受到一个载体。然而对于使用带有标签或标记基因的修饰Cas9蛋白时，使用单独载体更为可行，因为这些修饰使用All-in-one载体时会更容易触及载体装载上限，影响转导效率。一个改进的方式是使用表达Cas9蛋白以及gRNA的细胞稳转株（无论是持续表达抑或诱导表达），尽管这将耗费更多的时间和人力。

6.报告基因系统选择：将用于筛选的标记基因（如抗生素耐药性）或荧光报告基因（如GFP、RFP）整合到CRISPR载体中将有助于识别和分离成功转导或编辑的细胞。这一步骤可以显著提高实验的效率和准确性。

7. 基因递送系统选择：递送方法因靶细胞的种类、体内的位置和应用方式而异。病毒载体（比如慢病毒或AAV）是针对难转染细胞和体内应用的理想选择，他们具有高的转导效率，并且可以选择瞬时或长期表达。然而需注意病毒载体的生产复杂，并且可能会带来更高的免疫原性和毒性。非病毒方法，比如基于脂质纳米颗粒的转染或电穿孔，实施起来更为简单，但通常与较低的递送效率相关，可能难以应用于某些细胞或组织类型。

8. HDR系统的供体DNA选择：对于使用HDR原理精确编辑，ssODN通常用于短序列的插入（<60 bp），如小型蛋白标签或点突变；而dsDNA供体则允许插入更大的序列（高达4-5 kb），例如荧光标签或报告基因。

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