科研干货 | 成功的CRISPR文库筛选，需要做哪些前期准备？

对于CRISPR混合文库筛选，需要将携带特定gRNA的载体（通常也携带有Cas9）导入体外或体内的靶细胞。随后给予选择压力，比如加入药物或通过生长竞争，筛选出具有特定行为的细胞（比如观察其存活性或标记物表达）。随后，通过高通量测序识别关键基因、信号通路和分子网络。CRISPR筛选的方式包括敲除（KO）、CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi），每种方法均可针对特定的研究目标而实施，从而帮助我们加深对相应细胞过程和疾病机制的理解。

生物学系统的选择至关重要。筛选方法可分为体外和体内两大类，而体内筛选又进一步细分为直接法和间接法。直接体内筛选是将gRNA文库直接递送到靶器官，这种方法保留了细胞间的相互作用和组织结构，具有更高的生理相关性。

然而，向特定器官递送gRNA文库是一项颇具挑战性的技术，尤其是在处理大型文库时，可能需要收集多只动物的样本才能确保足够的覆盖度。相比之下，间接体内筛选则是先在体外将gRNA文库导入细胞，再将这些细胞移植到组织中。尽管这种方法可以规避直接递送的某些限制，但它仅适用于支持细胞移植的生物学系统。

体外筛选因其简单性和易扩展性而备受欢迎，其常用的细胞类型包括原代免疫细胞、神经元细胞或永生化癌细胞系，其中后者因其稳健性和易于维护等优势而成为大型筛选的理想模型。gRNA文库通常通过慢病毒的形式以低感染复数（MOI）递送，这可以确保大多数细胞都接收到单个gRNA。为实现基因编辑，Cas9和gRNA需在靶细胞或组织中共表达。体内筛选常使用Cas9敲入小鼠等转基因动物模型，并且通过条件性的（如Cre依赖性）Cas9表达减少脱靶效应。体外或间接体内筛选可通过慢病毒、转座子系统或在gRNA文库中引入Cas9。

gRNA文库设计也是实现成功筛选的重要环节，需考虑诸如应用场景、文库规模、每个基因对应的gRNA数量和载体的设计等方面。CRISPR敲除文库通过永-久性地破坏基因从而可产生明显的表型，但也可能因此干扰了关键的生物学功能。CRISPRi和CRISPRa使用无催化活性的Cas9调控基因表达，脱靶风险较低，适合用于研究必需基因或非编码RNA。

gRNA文库分为两类：1）全基因组文库，针对整个人类或小鼠基因组；2）靶向文库，针对特定基因集合或通路（如转录因子或长链非编码RNA）。全基因文组库提供无偏好的结果，但是需要使用更多的材料；靶向文库则基于已有知识开发，对材料的利用效率更高。每个基因对应的gRNA数量则会影响命中识别——采用4-6个gRNA可显著提高命中效果，此外也常用双gRNA系统以进一步增强敲除效率。

载体的设计方式直接影响筛选效果。对于不表达Cas9的细胞，载体需同时表达Cas9以及单/双gRNA。单gRNA适用于标准的编码基因敲除，而双gRNA则可通过删除靶区域实现更强的敲除效果。CRISPRi/CRISPRa筛选需要设计靶向启动子或增强子序列的gRNA。此外，引入选择标记（如EGFP和嘌呤霉素抗性基因）有助于识别转导成功的细胞。

对于病毒系统的选择，慢病毒相当常用，其具有在多种细胞类型中的高效表达的特点。如果需要对体内或特定细胞类型递送，则腺相关病毒（AAV）更为适合。一些特定的载体设计方式，比如使用不同U6启动子驱动双gRNA的表达，可减少慢病毒包装中的重组，确保gRNA表达的稳定性。

在文库载体设计完成后，需合成gRNA寡核苷酸，并将其扩增后克隆到特定载体中。验证文库质量至关重要，建议先对随机选取的多个克隆进行Sanger测序，以确认克隆的准确性，随后通过下一代测序（NGS）进行全面验证。通过将NGS reads结果与参考gRNA列表进行比对，可以评估文库的覆盖度和均一性。关键指标如完全匹配reads的百分比以及分布中第90百分位与第10百分位之比（高丰度与低丰度gRNA的reads比值）可以反映文库是否均一分布。高覆盖度和高均一性是实现无偏差筛选的关键因素。

总而言之，混合文库CRISPR筛选是研究基因功能和生物机制的有力工具，其成功取决于生物系统、文库设计的合理性以及文库制备的精心规划。文库的复杂度和载体设计将直接影响到数据的质量。