AAV小鼠体内实验：静脉注射篇

尾静脉注射

小鼠尾部有四根明显的血管，其中腹侧的一根为动脉，背部的一根为静脉，两侧还各有一根静脉。由于两侧的静脉比较容易固定，常作为尾静脉注射的部位。

1. 将动物固定在固定器中，使尾部充分暴露出。
2. 尾部用45-50℃的温水浸泡半分钟者将动物放置在靠近热灯源的位置5~10分钟使血管扩张。
3. ⽤75%⼄醇对待注射位点进⾏消毒并⽤纱布擦拭多余的⼄醇。
4. 使⽤带有27 G针头的0.5 ml注射器，吸取⾄少100 ul超纯化AAV病毒液。⼩⼼挤出针头中的空⽓。

注意：沿与静脉平行方向从尾下1/3处进针，针头刺入后若注射无阻力，表示针头已在静脉中，可继续注射；若注射时阻力较大并产生局部隆起或者红肿，说明注射到皮下组织，需拔出针重新刺入。

1. 移除针头，⽤⼲净纱布按压注射位点直⾄停⽌出⾎。将⼩⿏转移回原来的⿏笼。

颞（面）静脉注射
对于成年小鼠常规的静脉注射方式较容易进行，但是对于一些需要使用新生鼠的动物模型，颞（面）静脉在出生后2天即通过显微镜在头部清晰观察到，是更佳的注射位点。

1. 将新生小鼠放置于湿冰上30-60秒麻醉动物。注意避免将动物放置冰上久导致低温相关的并发症，如心室颤动、组织缺氧和代谢性酸中毒等。
2. 动物在冰上时，注射器吸取50 ul的超纯化AAV病毒液。
3. 通过以下方法确认动物完全麻醉：在显微镜下，动物在保持呼吸的同时，移动动物时动物不会活动。
4. 使用右手进行注射时，将动物的口鼻朝向右侧。将左手食指放在口鼻上，将左中指放在耳芽尾部，使耳芽位于食指和中指之间。
5. 确定颞静脉位置：颞静脉位于耳芽前部，周围毛细血管的下方。区分毛细血管和颞静脉的方式时，表皮毛细血管在揉动皮肤时会跟随移动，而颞静脉的位置始终固定。颞静脉呈现阴影状，从腹侧走向背侧，进入颈静脉。
6. 注射器针尖斜面插入颞静脉。正确进针后，可透过皮肤看到针尖斜面被血填充。缓慢轻推注射器开始注射，此时脸侧面的静脉变白。
7. 注射完成后，针头保持在静脉中10-15秒以防止注射液回流。

门静脉注射

门静脉注射属于向肝脏直接递送AAV病毒的给药方式，对比尾静脉注射，其靶向性更佳，所需病毒量更少。

1. 对小鼠进行异氟烷吸入式麻醉（5%异氟烷）。
2. 小鼠失去知觉后，对小鼠腹部局部区域去毛并使用75%乙醇消毒，然后将小鼠鼻锥放置于麻醉面罩里固定，用湿纱布覆盖眼睛以保湿角膜。
3. 使用75%乙醇清理并消毒手术区域，将小鼠放置于加热垫上。
4. 使用消毒后的剪刀在无菌布上剪开一个小孔，然后将无菌布覆盖于小鼠，暴露需要手术的腹部区域。
5. 对小鼠腹部从膀胱到剑突骨的区域做一个小于2.5 cm的皮肤切口。
6. 使用同样的方式打开腹部的肌肉层。
7. 使用组织拉钩将打开的皮肤和肌肉固定在左右两侧。
8. 在左边拉钩上方放置一小块浸润满PBS的无菌纱布。
9. 使用无菌棉签，小心地将肠子移动到左边的无菌纱布上，并反转胰腺以暴露出门静脉。肝门静脉位于胰腺的底部。
10. 当门静脉暴露后，使用棉签给门静脉附近的胰腺组织维持轻微的压力以创造组织张力，方便针头的插入。
11. 向胰腺的门静脉下方大约2 mm处入针，保持推进针头使得针头插入门静脉，直到可透过静脉壁看到针头。缓慢地将注射器中的超纯化AAV病毒液推入血管（可注射20-100 ul）。
12. 注射完成后，使用干的消毒棉签对入针处施加压力，缓慢地拔出针头并旋转棉签以覆盖注射产生的洞口，防止血液回流。
13. 棉签保持对门静脉按压30秒。切一小块可被组织吸收的止血材料放置在注射部位，然后将肠子放回腹腔。
14. 使用4-0丝缝线、无切割圆针、连续缝合法缝合腹壁。在皮肤上放置第二层缝线，使用4-0尼龙缝线、三角针、间断缝合法缝合皮肤。
15. 摘除麻醉面罩，注射镇痛剂（0.05–0.1 mg/kg卡洛芬）。
16. 对动物进行术后管理，术后10-14天拆除缝线。

参考文献
[1] Ahmed SS, Li J, Godwin J, Gao G, Zhong L. Gene transfer in the liver using recombinant adeno-associated virus. Curr Protoc Microbiol. 2013;Chapter 14:Unit14D.6.
[2] Gombash Lampe SE, Kaspar BK, Foust KD. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. 2014;(93):e52037.
[3] Sherman A, Schlachterman A, Cooper M, et al. Portal vein delivery of viral vectors for gene therapy for hemophilia. Methods Mol Biol. 2014;1114:413-426.

提示：从事动物实验应遵循我国《实验动物管理条例》、《实验动物质量管理办法》等相关法规要求开展工作。



 

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