载体家小课堂 | AAV小鼠体内实验：肌肉、腹腔和鞘内注射篇

肌肉注射（Intramuscular injection，IM）

肌肉在皮下包含大量的血管，肌肉注射将药物直接注射进肌肉深处后，药物可通过血流快速被吸收。小鼠肌肉注射操作步骤如下：

1. 固定动物，可以适当麻醉或者使用固定器。
2. 保持离你最近的小鼠后肢固定。
3. 注射位点：可以选择在股骨尾部的大腿肌肉进行注射，也可以选择在颅骨到股骨的股四头肌注射。
4. 手指划分出需要注射的肌肉块，对注射位点进行消毒。
5. 用尽量避免触碰到坐骨神经的方式入针。当使用大腿肌肉注射时，入针方向朝向尾部。若使用股四头肌注射，入针方向朝向头部。小鼠可使用25-30 G针头进行注射。
6. 稍微回抽针栓以确定是否刺入血管。若回抽有血液，则需要重新入针。如果回抽无血液，则可以缓慢开始注射。对小鼠而言，注射体积通常为25 ul。
7. 注射完成后抽出针管，观察是否有流血现象。如果发生流血，则按压注射处约1 min止血。
8. 将小鼠放回笼中并饲养观察。


腹腔注射（Intraperitoneal injection，IP）

腹腔注射是一种操作简单、快速且非侵入式的AAV载体递送方式。已经商业化的用于脂蛋白酯酶缺乏症的AAV基因治疗药物Glybera即是通过腹腔注射给药。腹腔注射的操作步骤如下：
1. 使用注射器吸取适量超纯化AAV病毒液（腹腔注射的给药体积最大可达10 ml/kg）。
2. 轻轻地将动物从笼子中取出，左手拇指和食指抓紧小鼠颈背，同时用无名指和小指固定尾巴和后肢。小鼠腹部向上，头部应稍向后方倾斜并低于腹部的水平面位置，有助于使内脏移向上腹。
3. 识别注射的腹部区域。注射部位通常在小鼠的右下腹离腹白线约1 cm处，以避免损伤膀胱、盲肠等腹部器官。如果需要连续多日注射。可以左右换边注射，但是需要注意动物护理。
4. 腹腔注射时，75%乙醇消毒注射部位，然后右手持注射器在以高于腹部水平面30-40°位置进针。
5. 到达皮下后，向头部倾斜方向继续稍向前进针以刺入腹腔。腹腔注射通常使用25-27 G的针头，插入1/2的长度为佳。
6. 针尖通过腹腔后抵抗力消失。回抽针栓，如无回血或液体方可注入药液。注射可在 1-2 秒内完成，注射时不要让针管在腹部内移动。

注意：回抽针栓时若发现吸入绿色物质可能表明肠道被刺破，吸入黄色液体则可能表明膀胱被刺破。若发现血液则表明腹部血管被刺破。含有血液、尿液或者胃肠道内容物的针头/注射器不可继续使用，应丢弃后使用新的注射器和针头重新注射，并并密切监测动物任何疼痛、疾病等迹象。

7. 注射完成后，将针头笔直拉出。每只动物注射均使用新的针头和注射器。
8. 将动物放回笼中，继续饲养观察。


鞘内注射（Intrathecal injection，IT）

鞘内注射的目的是通过将药物注射进蛛网膜下腔来使其在脑脊液（Cerebral spinal fluid, CSF）中传递扩散。将AAV病毒载体注射到脑脊液中可以对整个中枢神经系统中实现广泛的基因转导。以下为操作步骤：
1. 准备AAV注射液：在95 ul 超纯化AAV病毒液中加入5 ul的局部麻醉药（20%盐酸利卡多因），使用枪头轻轻吹打混合。放置冰上暂存（每只小鼠可注射8ul）。
2. 使用27 G针头吸取8 ul注射液，注意赶走气泡。
3. 使用75%乙醇消毒超净工作台后，小鼠背部朝上，用非惯用手拇指和食指/中指抓住小鼠的髂骨固定小鼠于超净台中的手术板上，同时用消毒的纱布或者毛巾覆盖小鼠上半身以使其冷静。抓好小鼠后保持拇指和食指之间的小鼠背部皮肤张力。
4. 对背部注射区域的皮肤剃毛并消毒。
5. 用惯用手的拇指或食指感受双侧髂骨中线位置的椎间隙，用指甲按出压痕以指示L5-L6的椎间隙作为注射位置。
6. 轻微旋转尾巴基部以指示脊柱中线。注射前调整针头斜面使其朝向动物头部。
7. 确保动物固定牢固，并将针管沿脊柱中线对齐。
8. 将针头轻轻垂直（或稍微倾斜70-80°）插入压痕的交叉处，注射器保持垂直。当触碰到骨头时，将角度慢慢减小到约30°，然后将针头滑入椎间隙。

注意：明显的突然甩尾现象是成功插入椎间隙的标志。针头一旦进入椎间隙就会感觉到被牢牢夹住。小鼠中一般使用27 G针头注射。

9. 开始注射，以每4s 1 ul的速度推入AAV注射液。注射后保持针头位置约1 min，然后轻柔地旋转拔出针管以避免漏液。
10. 注射完成后，马上对小鼠肢体的活动功能进行评估，标准如下：
0分，肢体无虚弱状态；
1分，后肢轻微无力，无步态异常；
2分，后肢中度无力，步态异常明显；
3分，后肢完全瘫痪；
4分，后肢完全瘫痪；气短，伴随前肢中等无力；
5分，四肢完全瘫痪，明显气短。
11. 将小鼠放回笼中，麻醉状态过后再次评估其肢体活动功能。



参考文献
[1] https://www1.udel.edu/research/pdf/Intramuscular-Injection
[2] https://animalcare.ubc.ca/animal-care-committee/sops-policies-and-guidelines/standard-operating-procedures
[3] Li D, Li Y, Tian Y, Xu Z, Guo Y. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J Vis Exp. 2019;(144).


注意：从事动物实验应遵循我国《实验动物管理条例》《实验动物质量管理办法》等相关法规要求开展工作。


 

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