载体家小课堂 | 带你了解AAV血清型（上）

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一种已知不会人类致病的依赖性细小病毒（Dependoparvovirus），其复制需要腺病毒或者HSV等辅助病毒才能完成自身生命周期。早期年代AAV由于其非致病性而未受病毒学家重视，但是自1980年代重组AAV2病毒载体首次获得克隆后，重组AAV日渐称为基因治疗研究的流行工具^[1]。重组AAV作为基因治疗和基因递送载体具有以下优点：无宿主基因组整合风险、可转导分裂和非分裂细胞、病毒基因成分可完全去除、AAV血清型有组织嗜性、体内转导免疫原性低等。


天然AAV血清型的发现

AAV最早在腺病毒制备过程中发现，起初被认为是污染物或者腺病毒亚基，经过进一步的纯化分离和血清试验，表明这些颗粒是抗原性不同于腺病毒的一类新的病毒^[2]。目前自然界各物种上发现的AAV变体超过100种，但是并非全部都经过血清型分类，而在灵长类身上分离出的代表性AAV血清型涵盖了AAV1-13。其中AAV1、AAV2、AAV3最早分别是从类人猿SV15腺病毒、Ad12腺病毒、Ad7腺病毒中分离出来的，AAV4最初则是从感染了SV15腺病毒的非洲绿猴上进行了分离^[2,3,4]。1983年，Hausen等人从人阴茎尖锐湿疣中成功分离出AAV5^[5]。由于人类群体中对AAV2、3、5广泛具有相应的抗体，研究认为这几种血清型是人源的。AAV4抗体在猿猴身上更多被发现，因此认为AAV4的天然来源是非人灵长类。至于AAV1的灵长类来源物种则仍具争议^[6]。

AAV6起初也是从人腺病毒制备过程中发现的，但是由于其序列与AAV1过于相近，因此也有人认为AAV6并非真正独立的AAV血清型，而是AAV1与AAV2的重组产物（一个新的AAV血清型严格来说需要在血清测试上表现出与已知血清型足够的差异）^[7]。

与AAV1-6的发现不同，AAV7、AAV8和AAV9最初并非是以活病毒的形式得到分离，而是通过信号PCR的方式从组织中对AAV的基因片段复原出来的。Gao等人从猕猴身上分离出AAV7和AAV8，而AAV9最初则是从3个人类个体身上分离出来的^[8]。此外，AAV10和AAV11是从食蟹猴身上分离的^[9]。

实际上，Gao等人发现在人类的不同组织中均广泛分布有不同类型的AAV基因组序列。根据这些序列的遗传相关度，天然AAV血清型呈现出6个进化枝^[8]。


AAV进化枝

AAV的6个进化枝分为两个单系群，其中一系包含人类特有的进化枝A，B和C，另一系包含仅从人类分离出来的进化枝F、仅从非人类灵长类分离出来的进化枝D，以及仅来自人类和非人类灵长类的进化枝E。每个进化枝上的代表性血清型有AAV1/AAV6（A类）、AAV2（B类）、AAV2-3杂合（C类）、AAV7（D类）、AAV8（E类）和AAV9（F类）。AAV3、AAV4和AAV5则归属于独立克隆^[10]。
当前，国际病毒学会将AAV总体上划分为两个物种：其中AAV1-4和AAV6-13属于腺相关依赖性病毒A（Adeno-associated dependoparvovirus A），AAV5则属于腺相关依赖性病毒B（Adeno-associated dependoparvovirus B）^[11]。




AAV血清型的关系与Cap基因序列以及其编码蛋白的结构相关。Cap基因编码AAV衣壳蛋白VP1（≈82 kDa）、VP2（≈73 kDa）和VP3 (≈61 kDa)，比例接近1:1:10。Mietzsch等人总结了AAV1-13的进化分支图。不同的AAV血清型之间可通过VP1/VP3的氨基酸序列相似度以及蛋白结构叠加比对的相似度进行比较^[12]。


AAV血清型的体外转导系统性测试

选取合适的AAV血清型通常是每个AAV实验者初期均需要面对的问题。由于AAV血清型来源复杂，以及各种文献中实验对象、实验条件、转导方式的差异性，实验者通常难以把握每种AAV的转导性能。
在体外试验中，为排除不同的载体设计、病毒批次以及细胞传代数等可能对病毒转导效率产生影响的因素，云舟生物一次性对18种AAV血清型且面向不同类型的细胞进行了转导效果测试，以为每位AAV实验者提供更全面的参考：


                 
CMV启动子驱动EGFP表达的18种血清型的AAV病毒载体（VB010000-9394npt）转导293T、HeLa和Huh-7细胞（24孔板，每孔转导>1x10¹⁰ GC AAV），转导后48小时进行荧光拍照。流式细胞术测定荧光强度中值（Mean Fluorescence Intensity，MFI）和EGFP阳性率。AAV8的MFI位于所有血清型的中间值，因此作为计算相对MFI的基准。转导效果显示AAV1、2、3、6等进化支上相近的血清型可能有着相近的转导性能。



参考文献
[1] Coura Rdos S, Nardi NB. The state of the art of adeno-associated virus-based vectors in gene therapy. Virol J. 2007 Oct 16;4:99.
[2] Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 1966 Jun;55(6):1467-74.
[3] ATCHISON RW, CASTO BC, HAMMON WM. ADENOVIRUS-ASSOCIATED DEFECTIVE VIRUS PARTICLES. Science. 1965 Aug 13;149(3685):754-6.
[4] Parks WP, Green M, Piña M, Melnick JL. Physicochemical characterization of adeno-associated satellite virus type 4 and its nucleic acid. J Virol. 1967 Oct;1(5):980-7.
[5] Bantel-Schaal U, zur Hausen H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 1984 Apr 15;134(1):52-63.
[6] Wu Z, Asokan A, Samulski RJ. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol Ther. 2006 Sep;14(3):316-27.
[7] Xiao W, Chirmule N, Berta SC, McCullough B, Gao G, Wilson JM. Gene therapy vectors based on adeno-associated virus type 1. J Virol. 1999;73(5):3994-4003.
[8] Gao G, Vandenberghe LH, Alvira MR, Lu Y, Calcedo R, Zhou X, Wilson JM. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 2004 Jun;78(12):6381-8.
[9] Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. Virology. 2004 Dec 20;330(2):375-83.
[10] Zhang R, Xu G, Cao L, Sun Z, He Y, Cui M, Sun Y, Li S, Li H, Qin L, Hu M, Yuan Z, Rao Z, Ding W, Rao Z, Lou Z. Divergent engagements between adeno-associated viruses with their cellular receptor AAVR. Nat Commun. 2019 Aug 21;10(1):3760.
[11] Genus: Dependoparvovirus. ICTV. (n.d.). Retrieved April 24, 2022, from https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/ssdna-viruses/w/parvoviridae/1043/genus-dependoparvovirus
[12] Mietzsch M, Jose A, Chipman P, Bhattacharya N, Daneshparvar N, McKenna R, Agbandje-McKenna M. Completion of the AAV Structural Atlas: Serotype Capsid Structures Reveals Clade-Specific Features. Viruses. 2021 Jan 13;13(1):101.



 

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