载体家小课堂 | 带您了解自扩增RNA（saRNA）

体外转录（In vitro transcription，IVT）的自扩增RNA（Self-amplifying RNA，saRNA）是目前使用RNA研发新型药物和疫苗的新兴技术。IVT saRNA在保持了传统mRNA的可快速开发、模块化设计、无细胞化生产、高安全性等特点的同时，最大的特点是其进入细胞后具备自我复制扩增的能力，提升了IVT mRNA的表达效果。

当前常用的应用于saRNA设计上的Alphavirus的复制酶序列主要来源于委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV）和森林脑炎病毒（Semliki Forest virus，SFV）等。

saRNA复制和表达机制

 

saRNA作为正链RNA分子，进入细胞后首先被核糖体翻译出四个非结构蛋白组分nsP1、nsP2、nsP3和nsP4，这四个组分以多聚蛋白的形式组装成一个RNA复制酶复合物(此处简称为Replicase，Rep)。nsP1-4均具有其特有的功能，其中nsP4扮演着以RNA为模版的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRP）的角色。Rep首先利用初次进入细胞的saRNA合成saRNA负链，再以负链为模版合成新的saRNA拷贝，从而实现saRNA的自扩增。同时，Rep也识别sgPr，然后自其下游开始合成亚基因组RNA（Subgenomic RNA）。这些亚基因组RNA在宿主细胞中大量累积，可接近10⁶拷贝数。在saRNA疫苗设计中，亚基因组RNA编码的抗原基因将翻译出大量的抗原分子并触发细胞抗原呈递。

saRNA的优势^✦

1.低注射剂量

saRNA由于可自我复制的特点，为达到同等水平的免疫应答，其注射剂量相对传统IVT mRNA可以做到显著降低。如说正处于临床III期的COVID-19 saRNA疫苗ARCT-154，其注射剂量(5 ug/dose)比Pfizer-BioNTech的传统mRNA疫苗小6倍，比Moderna的则小20倍。这种优势在需要快速应对疫情爆发时尤为突出，因为较低注射量一方面有利于减少疫苗生产成本，另一方面也有利于物流运输和疫苗分发，提升接种覆盖率。

此外，saRNA在体内自我复制导致其表达抗原蛋白的时间更长，从而引发相对更持久的免疫应答，即接种一针可达到传统mRNA疫苗接种两针的效果。这对于治疗性的RNA药而言，以更少的应用剂量和给药次数也可减轻mRNA递送载体可能产生的毒副作用。

2.双链RNA结构

saRNA在复制时会形成双链RNA结构，这种结构类似病毒RNA基因组，可以被细胞的体内模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)识别并激活细胞先天免疫反应，因此可能进一步提升saRNA作为疫苗时的免疫应答效果。但是若这种免疫激活过强则可能反向抑制saRNA的表达效果，故需通过对序列精心设计和修饰以调整saRNA的免疫原性。

 

云舟生物saRNA开发与制备服务

云舟生物提供一站式的saRNA开发与制备解决方案。我们的mRNA设计团队拥有丰富的mRNA设计与生产经验，可以帮助研究者完成体外转录载体设计、载体克隆、体外mRNA合成、mRNA-LNP复合物制备、以及体外/体内的mRNA功能性测试，以加速mRNA疫苗与相关基因疗法的药物研发。

云舟生物IVT saRNA载体图谱
 

云舟生物向HEK293T细胞转染表达EGFP的IVT saRNA和IVT mRNA，其中saRNA的表达效果更佳。

细胞生长于12孔板，每孔分别转染1 ug EGFP-mRNA和EGFP-saRNA。

(A)转染后24 h、48 h和7天的EGFP荧光表达效果。曝光时间：30 ms。

(B)转染后24 h测定HEK293T细胞的平均荧光强度（MFI）。

针对saRNA我们可提供以下服务类型：
1.IVT saRNA载体设计
√ 为目的序列添加经过性能验证UTR序列和poly(A)尾巴。
√ 引入修饰核苷如m1Ψ、5moU等。
√ 生产可进行下游线性化、加帽、多聚腺苷酸化的定制的 IVT 载体。

2.saRNA体外转录和LNP封装
√ 5' Cap 1加帽和3' poly(A)加尾。
√ 引入修饰核苷如m1Ψ、5moU等。
√ 针对saRNA分子特性使用恰当的LNP配方进行封装。

3.验证saRNA基因递送效果
√ 实验导向策略优化UTR序列、编码序列以及saRNA生产方法。
√ 搭建saRNA相关的功能性验证平台用于验证抗原呈递和抗体表达。
√ 动物模型验证LNP-saRNA复合物的递送效率和安全性。

 

想更了解云舟生物IVT mRNA服务，点此查看mRNA基因递送解决方案

 

参考文献

1.Bloom, K., van den Berg, F., & Arbuthnot, P. (2021). Self-amplifying RNA vaccines for infectious diseases. Gene therapy, 28(3-4), 117–129.

2.Lundstrom K. (2021). Self-Replicating RNA Viruses for Vaccine Development against Infectious Diseases and Cancer. Vaccines, 9(10), 1187. 

3.Blakney, A. K., Ip, S., & Geall, A. J. (2021). An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vaccines, 9(2), 97.

4.The ARCT-154 self-amplifying RNA vaccine efficacy study(ARCT-154-01),from https: //clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT05012943