Cre重组酶来自P1噬菌体，它在Cre-lox系统中起着核心作用。Cre一词最初来源于“导致重组（causes recombination）的缩写，但如今也被称为“环化重组酶（Cyclization recombinase）”。这种酶具有识别特异性DNA序列（即loxP位点）并与之相互作用的能力。
 

LoxP位点，即“交叉（x）P1位点（Locus of crossover (x) P1）”，是一段特定的DNA序列，由两个13 bp的反向重复序列以及一个处于它们之间的8 bp的核心序列组成。Cre是一种特异性的重组酶，识别该反向重复序列和核心序列。当两个LoxP位点被放置在相反的方向时，Cre重组酶会导致两个位点之间的DNA链反转（Inversion）。
 

另一方面，当两个LoxP位点被放置在相同的方向时，Cre重组酶会导致位点之间的DNA链切除（Deletion）。如果在基因组中的不同链的位置将LoxP位点配对并朝向同一方向放置（图1），则会发生DNA链互换实现基因转座（Translocation）。
 

 

图1 Cre-lox系统介导的DNA重组机制

 

Cre-lox系统的这种独特性质使其在基因工程中得到了广泛应用。Cre-lox系统最受-欢迎的应用之一是用于生产基因修饰小鼠。研究人员在靶基因周围策略性地放置loxP位点，从而创建了一个“floxed（flanking/flanked by LoxP）”基因。这些小鼠随后与转基因小鼠交配，后者在特定启动子的调控下表达Cre重组酶，从而允许在时间和空间上对基因修饰进行控制（图2）。
 

当Cre在特定组织或特定发育阶段被激活表达时，在loxP位点引发的重组反应可导致靶基因的表达变化。Cre-lox系统使得条件性敲除、激活或修饰靶基因成为可能，并且可对基因以一种受控和动态的方式进行研究。
 

Cre-lox在小鼠中的一个典型应用案例是建立肿瘤抑制基因p53的条件性敲除模型。该种模型可帮助研究人员探究p53在维护基因组稳定性和防止细胞失控生长的作用。通过Cre-lox技术激活RAS等致癌基因，则可研究它们在肿瘤发生和进展过程的贡献。另一方面，诸如PTEN、BRCA1/BRCA2和E-cadherin等基因的条件性敲除模型则助于了解这些基因在各种癌症（包括乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌）中的作用。
 

除了用于构建小鼠品系，Cre-lox系统还经常用于受控的体外遗传修饰实验。在这种方法中研究人员能够使用非病毒载体，比如将含有loxP位点的质粒引入细胞系中。这些loxP位点夹带的序列可以是目的基因、报告基因或其他功能元件。随后，一个表达Cre重组酶载体一同转染该细胞。细胞内的Cre的存在导致loxP位点之间的序列特异性重组，从而实现所需的遗传修饰。

图2 使用Cre-lox系统构建组织特异性基因敲除小鼠
 

Cre-lox FLEX系统
 

Cre-lox FLEX系统，也被称为FLEX（Flip-excision）开关，是经典Cre-lox系统的延伸设计，旨在提供更灵活且控制性更强的基因修饰。在FLEX中，使用Cre重组酶与称为“FLEX”位点的改良型loxP位点结合使用。这些位点被设计成具有不对称的方向和额外的旁侧序列，允许双向和可逆的遗传修饰。FLEX系统对于实现时间控制的基因表达相当有用。当Cre重组酶存在时，它可以催化FLEX位点之间发生重组，导致它们之间DNA片段的方向发生变化。根据其初始方向，这种变化可以引发基因的激活或失活。
 

“FLEX on”和“FLEX off”配置是指使用Cre-lox FLEX系统设计的两种载体的状态。在“FLEX on”状态时，目的基因以反向或反义链方向引入，会发生转录，但不能正常翻译表达。当Cre存在时，Cre介导的序列重组促使FLEX位点反转，目的基因激活表达。相反，在“FLEX off”状态时，目的基因默认处于表达状态，但当引入Cre时，目的基因方向反转不表达。Cre-lox FLEX系统的双方向和可逆表达的特性可帮助研究人员在时间和空间上精确控制转基因的激活或沉默，实现条件性和动态性的转基因表达。Cre-On载体（也称为“DIO”载体）表示目的基因处于“双floxed且反向”状态，而Cre-Off载体（称为“DO”载体）表示目的基因处于“双floxed且正向”状态（图3）。
 

Cre-Switch作为Cre-lox系统的另一种变体，允许在哺乳动物系统体外和体内中通过Cre介导两个ORF永-久性地切换表达。FLEX Cre-Switch系统使用两个配对的loxP变体重组位点，这些位点之间包含两个反向平行的ORF。Cre存在时，两个ORF的方向发生翻转，从而实现激活一个基因的同时抑制另一个基因的表达。Cre-Switch的载体设计引入了具有异质性的loxP变体（loxP和lox2272），以确保其对应的重组反应的特异性。两种loxP变体都由Cre识别，但只有与loxP和lox2272位点各自相对应变体的配对位点才能与其相互重组（loxP和lox2272位点之间不能重组）。

 

图3 Cre-On、Cre-Off、和Cre-switch的模式图
 

使用AAV递送Cre
 

利用包含组织特异性启动子的腺相关病毒（AAV）载体可以选择性地将Cre重组酶递送至特定细胞，特别是针对体内实验。通过将组织特异性启动子整合到AAV载体中，Cre重组酶的表达可以变得非常受控，确保Cre-lox系统其仅在特定细胞或组织类型中被激活。此外，通过结合Cre-lox和四环素诱导的启动子可进一步增强基因修饰在时间方面的可控性，其中Cre重组酶的表达受四环素调控。
 

条件性的基因修饰技术对于需要在受控的方式下对特定细胞或组织进行基因功能研究相当实用。该技术一个典型的应用是胰腺癌研究中TGFBI基因敲除小鼠模型的构建。使用一种表达Cre的重组AAV病毒（AAV8-mCD68-Cre）注射TGFBI flox/flox小鼠，鉴于CD68启动子确保Cre只在巨噬细胞表达，巨噬细胞中的TGFBI基因被条件性敲除。
 

与对照组相比，注射AAV8-mCD68-Cre的TGFBI flox/flox小鼠的肿瘤重量会明显减少，可以此观察TGFBI对胰腺癌生长的影响。可见，将Cre-lox系统结合传统AAV基因递送工具不仅提高了人工基因修饰的精准度，还将有助于研究人员探索更多疾病的分子机制并开发相关创新疗法。
 

参考文献

1. Zhou J, Lyu N, Wang Q, et al. A novel role of TGFBI in macrophage polarization and macrophage-induced pancreatic cancer growth and therapeutic resistance. Cancer Lett. 2023;578:216457.

2. Schnütgen F, Doerflinger N, Calléja C, Wendling O, Chambon P, Ghyselinck NB. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse. Nat Biotechnol. 2003 May;21(5):562-5.

3. Lee G, Saito I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 1998 Aug 17;216(1):55-65.