CRISPR基因递送系统指南（下）

慢病毒凭借与电穿孔相当的基因递送效率，成为CRISPR组分递送的热门工具，尤其适用于大规模CRISPR文库筛选。其优势在于可将转基因整合至宿主基因组实现长期表达，这对过表达实验具有重要价值。但基因组整合特性带来的插入突变风险，限制了其在临床体内应用，目前主要应用于基础研究及体外基因修饰，例如FDA已批准的CAR-T癌症疗法和治疗β-地中海贫血症的Zynteglo。

需注意的是，慢病毒递送CRISPR时Cas9的持续表达可能引发脱靶效应，而可诱导表达系统或整合酶缺陷型慢病毒（IDLV）可有效缓解这一问题——IDLV将基因组整合率降低约500倍。虽然其转导效率低于常规慢病毒，但在体外和体内神经元中的递送效率与常规载体相当，这为中枢神经系统疾病的治疗提供了独特潜力。

该体系当前面临两大技术瓶颈：首先是载体容量限制（约4.2kb），远低于慢病毒载体的装载能力；其次是转导效率相对较低。针对容量问题，研究者开发了多重解决方案：

①采用序列长度较小的SaCas9）；

②双载体共递送策略（分别装载Cas9与gRNA）；

③SpCas9分割表达技术，通过两个载体递送SpCas9片段在细胞内形成完整的SpCas功能蛋白。

值得注意的是，AAV系统具备独特的临床优势：多样化的血清型选择可实现组织特异性靶向，结合衣壳定向进化技术（通过体外/体内筛选优化衣壳蛋白），可进一步提升递送精准度和治疗效果。

尽管目前尚无基于AAV的CRISPR疗法获得FDA批准，但AAV平台已成功应用于其他基因药物。例如治疗脊髓性肌萎缩的Zolgensma^®，其商业化应用为CRISPR-AAV疗法的临床转化提供了重要参考。

基于腺病毒的基因递送系统在安全性方面表现突出，其非整合特性已通过多项临床试验验证，成为替代慢病毒的重要选择。相较于AAV和慢病毒载体，腺病毒具有显著扩增的装载能力，但高免疫原性可能干扰基因编辑效果。目前临床应用最广的Ad5血清型依赖CAR受体介导细胞转导，这限制了其组织适用性。最-新研发的Ad5/F35嵌合体成功突破CAR受体依赖性，同时gutless腺病毒载体（仅保留必要包装序列）不仅将降低了免疫原性，而且扩大了载体容量（可达33 kb），非常适合表达长的或多个转基因。

在临床转化方面，腺病毒载体已展现多重突破：

①遗传病领域：EBT-101作为首-个静脉注射型CRISPR-HIV治疗载体，已启动I/IIa期临床试验；

② 肿瘤治疗：多项临床前研究证实其在实体瘤靶向中的优势。

值得注意的是，虽然FDA已批准首-款腺病毒基因疗法，但基于CRISPR的腺病毒疗法还在临床实验阶段。