科研干货 | 如何通过优化poly(A)尾来提升IVT mRNA的使用效果？

近年来mRNA的疗法和疫苗在精准医疗领域中展现出巨大的应用潜力。mRNA能够表达多种蛋白质（如细胞内蛋白、跨膜蛋白和分泌蛋白），且无需担心基因组整合问题。这一技术在遗传病、传染病和癌症疗法的开发中日益受到青睐，并在首批获批COVID-19疫苗的快速设计与生产中发挥了关键作用。当前，科研人员仍在持续优化mRNA的稳定性、递送效率和免疫原性，其中poly(A)尾的长度对mRNA的稳定性和翻译效率至关重要。

 

Poly(A)尾是由70-200个腺苷酸组成的序列，存在于几乎所有真核生物mRNA的3'末端，在mRNA核输出、稳定性和翻译过程中起关键作用。以往认为较长的poly(A)尾可提升mRNA稳定性，但最-新研究表明poly(A)尾长度与mRNA动力学的关系极其复杂且尚未明确，现有证据显示mRNA稳定性下降与其翻译效率并无关联。

 

虽然poly(A)尾长度与翻译效率无直接相关性，但研究发现存在使mRNA转录本达到高效翻译的最优尾长。Poly(A)尾长度对调控mRNA稳定性和翻译效率具有决定性影响。阐明这些机制的确切原理，不仅对深入理解mRNA生物学至关重要，更能推动mRNA疗法的研发。凭借聚腺苷酸化和poly(A)尾在翻译调控中的动态特性，通过操纵mRNA生命周期来增强其治疗效果，是开发mRNA疗法和疫苗的核心策略。

 

人工poly(A)加尾

体外转录mRNA的多聚腺苷酸化在实验室中可通过两种不同方法实现：

1) 酶促多聚腺苷酸化；

2) 由模板编码的多聚腺苷酸化。

 

酶促多聚腺苷酸化反应在体外转录完成后进行。该方法将IVT mRNA与多聚腺苷酸聚合酶及ATP共孵育，从而在mRNA的3'端添加腺嘌呤残基。该方法的主要优势在于可通过调节核苷酸浓度、ATP浓度、酶用量、反应时间或这些参数的组合，灵活生成不同长度的poly(A)尾。虽然这种策略非常适用于前导研究或工艺优化，但由于需要使用额外的酶制剂，可能将对大规模生产显著提高其成本。此外，仅使用一次反应无法生成长度均一的poly(A)尾，其长度的分布差异较大。

由模板编码的多聚腺苷酸化需要在IVT质粒载体编码的目的基因末端添加一段胸腺嘧啶。进行体外转录时，T7 RNA聚合酶利用胸腺嘧啶模板合成poly(A)尾。该方法的主要优势在于单步即可完成反应，降低了制备成本，比酶促反应加尾更适合大规模生产。此外，该方法能产生poly(A)尾长度分布更为一致。然而，在质粒DNA上合成、克隆并保持长段胸腺嘧啶序列稳定具有较高的实现难度。首先，长段重复序列的合成与克隆通常是DNA合成的限制因素。其次，即便成功克隆到IVT载体并完成转细菌化，宿主菌株也容易对长段核苷酸序列进行重组，导致这些序列随时间推移发生丢失或降解。重复序列还会增加质检难度，因为Sanger测序等传统方法较难准确测定这类序列。

 

为最佳表达效果优化poly(A)尾长度

由于模板编码加尾法生成的poly(A)尾具有一致性高且可简化生产过程的优势，该方法通常成为适用于科研与治疗用途的IVT RNA加尾处理的首-选方案。为攻克长腺嘌呤序列合成与克隆的技术难题，VectorBuilder已优化开发出适用于多种poly(A)尾长度的IVT mRNA载体，这些载体可在细菌宿主菌株中保持稳定。

含有60-150核苷酸纯poly(A)尾的IVT mRNA载体稳定性评估。限制性内切酶消化从大规模大肠杆菌发酵中提取的质粒，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示含poly(A)尾的片段。 

 

虽然哺乳动物poly(A)尾经典长度约为200个核苷酸，但在研究和治疗应用中更常使用较短长度，这是因为其更容易制备且能仍然为翻译提供足够稳定性。我们的实验验证发现100个核苷酸的poly(A)尾长度可实现最佳蛋白表达，而进一步增加尾长并不能提高翻译效率。需注意的是，虽然虽然该机制可推广至其它IVT mRNA，但特定转录本的最佳poly(A)尾长度需根据具体情况而定。

Poly(A)尾长度与结构对翻译效率的影响。(A-B)将HEK293T细胞接种于12孔板，转染1 ug具有相同Cap1帽子及UTR，但不同长度poly(A)尾的IVT EGFP mRNA（如上所示）。

转染后通过流式细胞术定量检测EGFP表达水平，并于转染后24小时与48小时拍摄荧光图像。(C)对单细胞期斑马鱼胚胎显微注射250 pg斑马鱼EGFP IVT mRNA，注射后 6小时筛选表达EGFP的胚胎。

 

 

Poly(A)尾的质量控制

IVT mRNA的质量控制对确保其最佳的使用效果至关重要。然而，由于Sanger测序等传统方法较难测定poly(A)尾的重复序列，通常会使用更先进的技术手段进行测定，如毛细管电泳、LC-MS，NGS等。虽然毛细管电泳能可以测定poly(A)尾的精确长度，但该方法无法检测被测poly(A)尾内部存在的变异、突变或杂质。采用更先进的测序方法如NGS或Poly(A)-seq也存在诸多局限，比如增加的PCR扩增步骤会引入数据偏差，以及设备本身操作复杂、成本昂贵等问题。相对而言，LC-MS可精确且高效的测定IVT mRNA的poly(A)尾长度以及其异质性。这些方法的特性总结如下表。

 

总而言之，mRNA的Poly(A)尾对于mRNA在细胞质中的稳定性和高效翻译起着至关重要的作用。在实验室里，合成Poly(A)尾有酶促法和模板编码加尾这两种方法。尽管这两种方法各有特色，但模板编码加尾所产生的poly(A)尾长度更为一致，成本与突变风险较低，且符合GMP规范要求，目前已成为应用最为广泛的方法。 

 

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