随叫随到的基因沉默术！连必需基因也能被轻松拿捏~

在分子生物学研究中，通过短发夹 RNA（shRNA）的表达，可以有效抑制特定基因的转录后表达水平，从而研究基因功能或干预病理过程。同时慢病毒载体因其高效感染能力与基因组整合特性，成为 shRNA 稳定表达的主要工具。

 

然而，某些基因的持续沉默会对细胞生长、分化或生存造成严重影响，因此需要一种可控、可逆的调控策略。可被四环素（Tet）诱导的shRNA基因干扰载体为shRNA的时序性和可控表达提供了理想解决方案。该系统能在多种哺乳动物细胞系中实现靶基因高效的可控敲低，是研究细胞发育或生存相关的必需基因的有效工具。

 

Tet诱导型shRNA干扰载体在靶基因shRNA序列的上游引入了一个经过人工改造的人源U6启动子（U6/2xTetO），此启动子包含两段TetO操纵子序列。此外，在shRNA序列下游，由hPGK+intron启动子驱动阻遏蛋白（TetR）表达。该启动子中的β-珠蛋白内含子可通过剪接作用促进mRNA的核输出，经预测能够增强真核生物中的基因表达。

 

在Tet诱导系统中，TetR可与TetO相互作用，并通过添加四环素或其类似物来调控shRNA的表达。当环境中缺乏四环素或其类似物时，TetR会默认结合TetO元件并抑制shRNA转录；而当加入四环素或其类似物时，这些分子会与TetR结合，引发构象变化，使TetR无法结合TetO，从而让U6启动子驱动shRNA转录。 

Tet诱导型shRNA干扰慢病毒载体示意图

 

将Tet诱导型shRNA表达系统与第三代慢病毒载体骨架相结合，在保持大肠杆菌中质粒以高拷贝数复制的同时，包装形成的慢病毒可对多种细胞进行高效转导。第三代慢病毒系统经过特殊设计，剔除了载体骨架上病毒包装和转导所需的基因，这些基因由包装过程中使用的辅助质粒携带。因此，此类慢病毒载体产生的病毒为复制缺陷型，具有很高的安全性，即能转导靶细胞但无法在其中复制。此外，该载体可将靶基因的shRNA表达框稳定整合至宿主基因组，从而实现一个可长期通过四环素或其类似物调控shRNA表达来进行基因敲低的系统。 

 

总体来说，应用Tet诱导型的shRNA基因干扰载体具有以下方面的优势：

研究必需基因

持续敲低必需基因可能导致细胞死亡，难以研究其功能。利用 Tet 诱导系统，可以在实验的特定阶段启动shRNA表达，避免早期致死效应。

时序性基因调控研究

在细胞分化、发育和疾病进展过程中，某些基因的作用具有时间依赖性。Tet诱导系统允许研究者在关键时间点诱导基因沉默，从而更精确地分析其生物学机制。

动物模型建立

将该类型慢病毒载体导入小鼠或其他动物体内，可以实现长期且时序可控的基因敲低，为疾病建模和药物靶点验证提供工具。

毒性更低的诱导药物

可采用多西环素（Dox）作为诱导药物，具有性质稳定、低毒性和高诱导效率的优点。

 

需要注意的是，Tet诱导的shRNA基因干扰在shRNA的表达量上可能不如IPTG诱导的相关系统具有明细的“开/关”特征，但是Tet诱导系统对Dox等药物的剂量依赖性更好，即便使用微量的Dox也可以促使shRNA表达。该系统的这种特性有助于更精确的shRNA表达调节，在应用于哺乳动物细胞实验中相当受欢迎。

云舟生物的Tet诱导型EGFP-shRNA干扰载体经过Dox诱导表达后，

对表达EGFP的HEK293T细胞的基因敲低效果。