从理论到实践：系统性掌握CRISPR文库筛选的关键因素与实验设计

体外转导慢病毒CRISPR文库时，通常引入抗生素抗性基因以选择成功筛选转导细胞。不同的细胞类型对抗生素的耐受性不同，因此需通过杀灭曲线实验确定最佳浓度：用一系列抗生素浓度处理细胞，通过细胞计数、流式细胞术或MTT实验评估细胞死亡率，选用杀死所有细胞的最低浓度作为“最佳”浓度。

同时，为避免过度的选择压力导致的细胞扰动，考虑到转导本身可能会降低细胞适应性，建议实际转导文库时使用比最佳浓度略低的抗生素浓度。此外，有些细胞（例如稳定表达Cas9的工程化细胞或HEK293T细胞）已有内在的药物耐受性，需仔细确认抗生素类型和使用浓度，确保获得有效且高质量的药筛效果。

虽然递送gRNA文库可使用多种类型的病毒载体，但慢病毒仍是体外CRISPR文库筛选中最常见的选择。在完成慢病毒文库构建后，由于转导效率在不同细胞类型之间可能存在显著差异，您应当专门在的您靶细胞中评估文库的功能滴度。准确的功能滴度测定对于后续计算筛选所需的细胞数量和病毒颗粒数量至关重要。

测定功能滴度时应注意需要使用合适的感染复数（MOI）。如果MOI过高，多个病毒颗粒会进入同一个细胞，导致多个整合事件，从而低估真实的功能滴度。根据文库载体的设计，可采用不同的方法来确定转导效率。若载体含有荧光标记（如EGFP），可以通过荧光显微镜观察或流式细胞术定量检测；若载体带有药物筛选标记，则可通过抗生素筛选后的存活细胞的比例来计算。

此外，由于qPCR法直接检测病毒DNA整合到宿主基因组的情况，因此可用于任何类型的慢病毒载体。需要注意的是，基于荧光或抗生素选择的功能滴度测定在操作上相对简单，但是标记基因的表达水平可能受到启动子强度、敏感性、载体结构以及载体大小等多种因素的影响，因此这类方法往往会低估真实的功能滴度。

一旦确定了功能滴度，即可基于生物学重复的数量、期望的文库覆盖度以及所选择的MOI来计算筛选所需的细胞数和病毒颗粒数。这些计算的方式会因筛选方法（体外或体内）而有所不同。

体外筛选

对于遗传筛选，建议至少设置两个生物学重复，并维持每个重复100-500倍的文库覆盖度，这可以确保每个扰动平均至少可以代表100个细胞。虽然更高的覆盖度有助于更好地代表每个变异，从而提高数据质量，但同时也会显著增加所需的细胞和病毒数量。在数据可靠性和实验资源可用性之间取得适当平衡，是确保筛选可行性的关键。在反向筛选中（那些降低细胞适应性的扰动会在强选择压力下被消除），推荐采用更高的覆盖度，以保持必需基因的gRNA的代表性。

需要特别注意的是，对于细胞传代、将转导后的细胞群体分成多个实验组等操作，都会降低文库的实际覆盖度。为了在下游每个实验组中维持预期的覆盖度，应提前考虑可能的细胞损失（如转导后的细胞死亡或分化不完全），通过初始接种更多细胞来进行补偿。

在选择转导的MOI时，首要目标是减少基因组中发生多个整合事件的细胞比例。对于混合文库的筛选，根据泊松分布通常推荐MOI为0.3。适当提高MOI还可以减少总体所需的细胞数。

间接体内筛选

间接体内筛选的流程是先在体外用gRNA文库转导靶细胞，随后将这些修饰后的细胞植入到动物模型中。与体外筛选不同，其所需的细胞数量不能仅基于文库复杂度和覆盖度直接计算，因为有效覆盖度会受到植入过程中细胞存活率的强烈影响。由于不同模型的植入效率差异较大，建议针对每个具体系统进行单独测定。一种测定方法是在体外生成标准曲线：接种一系列给定数量的细胞，模拟不同程度的“瓶颈”条件，然后测量gRNA丰度相对于输入文库的变化。通过将肿瘤或植入物中的gRNA回收情况与这些体外的标准比较，即可估算实际植入的比率，并据此计算达到可靠文库覆盖度（通常为每个gRNA为 200×–300×）所需的动物数量。

此外，细胞植入往往伴随较低的存活率和异质性组织生长，为解决这一问题，可采用CRISPR-StAR（Stochastic Activation by Recombination）技术。该技术通过独特的分子标识（UMI）来跟踪单细胞来源的克隆，并且仅在植入且存活的细胞开展筛选，从而最大限度地减少植入过程中随机的gRNA丢失对命中识别的影响。该系统利用诱导表达技术激活gRNA，可在相同微环境条件下直接比较携带或不携带功能性gRNA的克隆。由于可以克服传统分析中常见的高系统性噪声问题，该方法可降低所需的覆盖度，并进一步减少实现可靠筛选结果所需的动物数量。

直接体内筛选

向体内直接递送CRISPR文库的最大优势在于能够在细胞的原生环境中进行基因扰动，这种方式完整保留了细胞间相互作用、信号传导网络、组织架构以及代谢状态。然而，这种方式在技术上具有较大挑战性，递送策略及其效率高度依赖于靶器官和细胞的类型。常用方法包括使用病毒载体（如AAV或慢病毒）以及非病毒方法（如质粒DNA）。

对于任何递送策略，都需要重点考察有能多少gRNA能够进入每个细胞。与体外或间接体内筛选不同（可以通过低MOI实现每个细胞单个扰动），体内递送很难达到这种精确控制的水平。由于组织结构的复杂性以及递送产物在细胞类型、位置和可及性上的不均匀性，严格的单扰动要求在多数情况下不仅非必要，甚至往往不具备可操作性——因为这会大幅增加所需材料和动物数量。

相反，允许同一细胞内发生多个扰动可以显著降低材料的需求和整体实验成本。随后，在筛后分析阶段可以使用已建立的生物信息学方法对多个扰动信号进行逆卷积分析。

在确定了抗生素选择浓度、最佳转导MOI以及所需的细胞和动物数量后，即可正式开始筛选。对于体外筛选，典型的流程是：首先用慢病毒文库转导细胞，进行抗生素筛选以富集成功转导的细胞。随后将转导后的细胞群分为参照组和实验组，其中实验组暴露于特定的选择压力（如药物处理或反复传代），以鉴定表现出具有期望表型的细胞。

体外筛选策略主要有三种类型：

一、存活率筛选，通过寻找在承受选择压力后的存活细胞中富集或减少的gRNA进行筛选；

二、报告基因筛选，通过寻找具有报告基因高或表达低表达的细胞中富集的gRNA进行筛选；

三、行为筛选，通过识别影响细胞侵袭、迁移等基因的相关gRNA进行筛选。

如前所述，体内CRISPR筛选可根据gRNA递送方式分为直接和间接两种。从实验测量结果的角度分类，CRISPR筛选大致可分为基于读取次数型（Read-count based）和信息富集型（Information rich based）两种。基于读取次数的筛选方法应用最为广泛，它通过深度测序技术对扰动富集或耗竭情况进行定量分析，进而比较实验组与对照组之间的差异。这类筛选特别适合研究影响细胞存活、增殖或迁移的细胞扰动。如果结合了使用特定标记的细胞分选方法，还可以扩展用于研究细胞分化或信号通路的激活等过程。另一方面，信息富集型筛选将CRISPR扰动与单细胞组学技术或体内成像技术相结合，能够对复杂表型进行更有效的表征，适用于研究活体系统中的生物学问题。

总而言之，成功的体外和体内CRISPR文库筛选取决于多个关键因素，包括选择合适的抗生素浓度、确定细胞数量、病毒滴度以及选择最适合实验问题的筛选策略。通过对这些参数的优化，可以确保足够的文库覆盖度、有效降低背景噪音，并最终获得高质量的筛选结果。